前兩天開會老板居然說我不知道抗原抗體結合的原理？？？怒而整理了這篇文章（笑）。

我們常常會習慣性地使用一些（昂貴的）一抗，雖然壓根沒管上面的標識。但是如何選擇合適的二抗呢？兔子，耗子，山羊該怎么選擇？IgG是啥？IgM又是啥？輕鏈重鏈又是啥？都知道要把抗體畫成一個Y字形，這又是為何？

我在逛抗體公司NOUVS的主頁的時候^[1]發現了這份二抗使用手冊《Secondary Antibody Handbook》，是我見過講的最清楚作圖最優美的一份使用手冊。于是今天就分享給大家。我發現里面還有很多使用手冊，比上實驗課的時候講的細致多了呢。。

二抗用于檢測細胞或組織樣本中的蛋白表達。它與抗原特異性一抗結合，二抗可檢測目標蛋白中的高度特異性氨基酸序列。二抗對一抗的指定區域或區域的特異性允許多個二抗與單一一抗結合，放大信號并增加檢測敏感性。在進行IP,WB,IHC,IF或者FLOW，ELISA等實驗的過程中我們都會去思考如何選擇合適的二抗。

一、抗體結構

抗體是由三個等大小區域組成的y形分子。一個柔性鉸鏈連接抗體桿(Fc)到抗體的臂(Fab)。兩個抗體的作用是結合抗原，而柄區決定抗體的同型和功能特性。每只手臂由一條重鏈和一條輕鏈組成。此外，這些重鏈和輕鏈由一個可變結構域(VL或VH)和一個恒定結構域(CL或CH)組成。重鏈和輕鏈的可變區域(V)在抗體之間不同，并賦予其同源抗原的抗體特異性。Fc柄幾乎沒有變化，但對與效應分子和細胞的相互作用是重要的。

二、二抗術語

Host Species 宿主物種:用來生產二抗的物種。

Format格式:二抗的結構樣式。

Species Reactivity 物種反應性:二抗識別的物種。

Target ig靶免疫球蛋白:二抗靶向的免疫球蛋白類或亞類。

Specificity二抗特異性:二抗識別的免疫球蛋白靶區。

Label檢測標簽:附于二抗上的標簽或偶聯物。

二抗是一種針對免疫球蛋白(抗體)分子的抗體。在最佳條件下，在免疫分析(間接檢測)中，二抗特異性結合一抗的種和類。注意，二抗不能直接與目標蛋白表位結合，也不能賦予目標表位特異性，這是由一抗決定的。二抗的標簽則決定檢測方法。二抗從用另一種抗體免疫的動物產生。免疫抗體的規格(例如，種、亞類、片段等)決定所產生的二抗的特異性。例如，兔子抗鼠藥IgG2b (H+L)二抗由大鼠IgG2b免疫球蛋白分子重鏈和輕鏈免疫家兔產生。

二抗增加了檢測的敏感性，因為多個二抗結合到一個一抗的能力(信號放大)。二抗的使用也為多重標記實驗提供了更大的靈活性，因為市場上的二抗被預先標記在不同的標簽上。

直接檢測:針對目標物的單偶聯抗體。

間接檢測:未偶聯一抗與偶聯二抗結合使用。

1.二抗宿主物種（這是首要考慮的問題）

二抗應與一抗針對同一物種，但不是在同一物種中產生。例如，小鼠一抗需要在小鼠以外的任何物種(如兔、山羊、大鼠、驢等)中培養的抗小鼠二抗。

tips

• 在多次標記實驗中，如果可能，所有二抗都應來自同一宿主物種。然而，所有的一抗都應該在獨特的宿主物種中培養。這就允許使用針對一種一抗的種特異性二抗，從而限制二抗和其他種的一抗之間的交叉反應。
• 為了限制二抗與近緣種培養的一抗結合，使用對近緣種預吸附的二抗。例如，在多次標記實驗中，一種抗小鼠二抗可能與一種大鼠一抗發生交叉反應。使用對大鼠吸附的抗小鼠二抗可減少交叉反應性。注:在考慮對近親屬物種(如大鼠和小鼠)預先吸附的二抗時，應給予謹慎。吸附可消除高親和力抗體，導致信號減弱。
• 為了減少非特異性染色，減少背景信號，用同一宿主的血清作為二抗進行阻斷。

2.二抗形式（我平時似乎很少考慮到這個問題）

二抗的形式是指二抗本身的結構。整個抗體可被胃蛋白酶裂解以消除抗體的Fc部分，產生F(ab’)2片段抗體:抗體的兩個臂和鉸鏈區。用巰基乙醇進一步裂解F(ab')2片段，去除F(ab')2片段的一個臂，產生一個F(ab')片段:抗體的一個臂和鉸鏈區。注意，F(ab')片段在結構上與F(ab)片段不同:F(ab)片段是由整個免疫球蛋白的木瓜蛋白酶裂解形成的，缺乏F(ab')片段中存在的鉸鏈區域。

注意:當考慮二抗時，重要的是不要混淆格式和特異性。考慮這個二抗:山羊F(ab') 2抗人IgG F(ab)二抗。第一個F(ab') 2標識為二抗格式，第二個F(ab)標識為二抗特異性。在這個例子中，二抗由F(ab') 2部分(格式)組成，并且對一抗的F(ab)區域有特異性(特異性)。

什么時候使用Fab片段二抗？

對Fc受體高表達的細胞進行染色

在白細胞群(如巨噬細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞等)細胞表面表達的Fc受體可與抗體s Fc部分結合，導致非特異性結合和背景信號增加。在對表達大量Fc受體的組織或細胞(如淋巴結、脾臟、外周血等)進行染色時，建議使用Fab片段二抗。二抗Fc部分的缺失消除了二抗與樣品中表達的Fc受體的結合。

表達Fc受體的細胞或組織的F(ab’)2片段二抗染色

使用來自同一宿主物種的一抗進行雙重標記

F(ab)片段二抗可與來自同一宿主種的兩種一抗進行雙重標記。由于每個F(ab)片段二抗只含有一個抗原結合位點(單價)，在隨后的孵育過程中不能結合另一個分子(即雙重標記時的第二一抗)。F(ab')2二抗是二價的(兩個結合位點)，不推薦用于雙重標記實驗。在結合第一個一抗后，二價二抗的第二結合位點可能被空置。然后，這個未占據的結合位點能夠結合第二個一抗，導致假陽性錯誤。

阻斷內源免疫球蛋白

二抗與內源性免疫球蛋白結合可增加背景信號。樣品用正常血清封閉后，用未共軛Fab (H+L)抗體孵育，會降低背景信號，增加特異性染色。

3.靶向免疫球蛋白

什么是抗體或免疫球蛋白類型?

抗體重鏈Fc部分的微小變化使抗體可分為五個獨特的類別:IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。五個類的重鏈分別用對應的希臘字母表示:α, δ, ε, γ和 μ。此外，由于進一步的重鏈變異，可以將IgG和IgA同型分為亞類。與抗體重鏈不同,輕鏈λ和κ是所有類之間共享。然而，每個抗體只表達一個輕鏈或另一個，從不同時表達。

二抗類別和分型

一抗應該用哪種免疫球蛋白?

單克隆抗體:二抗應針對一抗的類或亞類。例如，小鼠IgM一抗需要抗小鼠IgM二抗。有時，一個特定的子類(例如人類IgG2, IgG1)可能會被推薦使用。在這種情況下，針對更一般類別(即抗人IgG)的二抗可以用于單一標記實驗，因為大多數類特異性二抗可以識別單個亞類別。但在多次標記實驗中，當使用多個亞類特異性一抗時，應使用亞類特異性二抗來區分一抗。例如，使用IgG2和IgG1一抗的多次染色實驗需要使用抗IgG2和抗IgG1二抗。

多克隆抗體:當使用多克隆一抗，然后IgG二抗是推薦使用的，因為大多數多克隆抗體是IgG類免疫球蛋白。

4.二抗特異性

特異性是指一抗或免疫球蛋白被二抗識別的區域或鏈。這部分看了好幾遍也不是看得太懂，可能需要實際運用的時候在考慮吧。

抗IgG (H+L):一種具有(H+L)標記的二抗，靶向IgG分子的重鏈和輕鏈(即Fc和Fab區域)。這些抗體也會與其他類(如IgE、IgD等)發生反應，因為這些類之間共享輕鏈。更廣泛的表位識別(H+L)二抗使其適用于大多數需要二抗的免疫分析。

抗igg Fc片段或重鏈:與(H+L)二抗不同，以靶免疫球蛋白Fc區域或重鏈為靶點的二抗具有類特異性，不會與其他類免疫球蛋白發生反應。針對Fc片段的二抗被吸附在F(ab’)2片段上。如果打算在ip后進行western blot分析，建議使用重鏈特異性二抗來檢測大于55kd或小于45kd的蛋白的表達。針對(H+L)區域的二抗將識別用于免疫沉淀的一抗的還原和變性重鏈(50 kDa)和輕鏈(25 kDa)。此外，Fab片段抗fc二抗可用于一抗在多次標記實驗孵育前預標記。

抗IgG F(ab’)2片段:一種具有F(ab’)2標記的二抗，靶向于IgG一抗的F(ab’)2區。這些抗體被吸附在Fc片段上，但由于識別了F(ab)區域的共享輕鏈，它們會與其他類發生反應。

抗IgG輕鏈:一種輕鏈特異性二抗靶向IgG輕鏈(kappa或lambda)。這些抗體不與一抗重鏈反應，但識別其他免疫球蛋白類的共享輕鏈。例如，山羊抗人IgG Kappa輕鏈二抗不僅能識別IgG亞類，還能識別IgA、IgD、IgE、IgM等輕鏈。在ip后進行western blot分析時，建議使用輕鏈特異性二抗來檢測大于30 kDa蛋白的表達。western blot分析中使用的A (H+L)特異性二抗將識別免疫沉淀步驟中使用的一抗的重鏈(50 kDa)和輕鏈(25 kDa)。使用輕鏈特異性二抗，去除50 kDa的重鏈帶，可以清晰的檢測到大于30 kDa的蛋白。

tips:

• 當一抗的子類未知時，推薦一種針對輕鏈的二抗。在這種情況下，最常用的是抗igg (H+L)二抗。
• 針對輕鏈的二抗可與任何類結合;所有的類都表達了輕鏈。

4.如何確定正確的標簽

標簽的選擇取決于應用的手段。需要熒光檢測的檢測手段(如流式細胞術、免疫細胞化學、免疫熒光等)需要結合到熒光色素上的二抗。在設計每個實驗時，應考慮每種熒光的激發光譜和發射光譜。常見的熒光染料包括FITC、PE、APC、DyLight AlexaFluor或Atto染料。酶檢測需要結合HRP、堿性磷酸酶(AP)或生物素的二抗。親和素和鏈霉親和素結合生物素形成復合物的能力使信號擴增不依賴于二抗的宿主種類。由于過氧化物酶比AP更經濟、更穩定，HRPs在化學發光檢測系統中更受歡迎。然而，AP相對于HRP增強的敏感性使得AP在比色檢測中更為常見。

三、二抗和預吸附:如何限制交叉反應

3.1預吸附

預吸附是一種增加二抗特異性和最小化非特異性結合的方法，通過使抗體通過一個含有固定血清蛋白或免疫球蛋白的柱從潛在交叉反應的物種。反應性抗體與固定化蛋白結合，而非反應性抗體通過。

為了防止非特異性結合，在多次標記實驗中確定蛋白表達或染色富含免疫球蛋白的組織或細胞時，建議使用預吸附的二抗。

注:建議使用預吸附的二抗來對抗實驗樣品的種類。例如，在對小鼠組織進行染色時，建議使用吸附抗小鼠免疫球蛋白或血清的二抗。

3.2二抗的多重標記

在雙重或多重標記實驗中產生準確的數據需要每個二抗特異性地識別一個一抗。除了與一抗發生交叉反應外，二抗還能與其他二抗或研究樣本中表達的內源性免疫球蛋白結合。限制這些反應是產生準確數據的關鍵。

在獨特物種中培養一抗進行多次染色

為了同時檢測同一樣本中的多個蛋白，所有二抗都應在同一宿主物種中培養，并吸附于所有其他一抗物種以及被測樣品的物種。在同一物種中培養的二抗不能相互結合。吸附染色實驗中使用的其他一抗的宿主種的二抗以及樣品種，消除了二抗與內源性免疫球蛋白和其他一抗的交叉反應。

一抗在同一物種中多次染色

在實驗中，當無法使用來自特定物種的一抗時，亞類特異性一抗可用于對多種蛋白(如IgG1、IgG2b)染色。在這種情況下，推薦對所有其他一抗的亞類特異性二抗預吸附。

成像的多重標記-示例顏色組合

本文相對于原文有刪節^[2]。