各位小伙伴們下午好~

疫情當前，作為新型冠狀病毒的檢測手段之一，想必大家對qPCR檢測有一定的好奇，小編偷偷拿到了咱們技術老師的課件給大家來一波分享，往下看喲~

PCR的背景

自從聚合酶鏈式反應技術（PCR）被發明以來，由于其簡單、廉價、可靠、快速、靈敏的優質，PCR是分子生物學中使用最廣泛的技術。qPCR是由PCR技術發展出來的一種技術，通過在DNA擴增過程中，以熒光染料偵測每次PCR循環后產物總量的方法，不單有PCR的快速、靈敏，更有專一性更高、可實時監控、可重復精確定量等優勢。

圖1 PCR原理圖

PCR的種類及原理

根據化學發光原理可以分為：

1、SYBR染料法

2、TaqMan探針法

SYBR染料法

SYBR染料法利用SYBR GreenI分子的特點，SYBR Green I 是一種結合于所有雙鏈DNA（dsDNA）雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料。SYBR Green I 只有和雙鏈DNA結合后才發熒光，游離的染料分子不發光，在新合成鏈延伸過程中SYBR Green I 摻入雙鏈中，變性時DNA雙鏈解開，SYBR Green I 游離出來，無熒光。

在PCR反應體系中，加入過量SYBRGreen I 熒光染料， SYBR Green I 熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR Green I 染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。

SYBR染料法需要注意引物的特異性，因為非特異擴增產物和引物二具體均為dsDNA，所以SYBR染料法只能通過引物來保證特異性，SYBR染料法的優點在于簡單且成本較低。

圖2 SYBR染料法原理圖

圖3 TagMan探針結構

TaqMan探針法
核心是探針分子，TaqMan探針是單鏈DNA，5’端偶聯發光基團，3’端偶聯淬滅基團，游離的完整探針是檢測不到熒光信號的，發光基團發出的熒光會被淬滅基團吸收淬滅，探針被水解，發光基團和淬滅基團遠離就可以檢測到熒光信號。

反應開始時，模板鏈經熱變性解鏈形成單鏈，TaqMan探針優先跟模板鏈退火，引物隨后退火到模板上，之后進行鏈的延伸，延伸過程中Taq酶發揮5’-3’外切酶活性，遇到探針會從5’端逐個堿基切除探針，發光基團會跟淬滅基團分開，因此熒光檢測系統可以接收到熒光信號，每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，熒光信號的累積和PCR產物形成是同步的。

TaqMan探針法的特異性除了由引物提供，更由探針分子保證，因其退火溫度更高，所以TaqMan探針法特異性更好，在一個反應體系中加入多條探針，可以做多個基因同時檢測。

圖4TagMan探針法原理圖

PCR的定量方法

定量方法包括相對定量和絕對定量，兩者的重要差異在于相對定量的結果是差異性的結果，涉及比較；而絕對定量的結果是一個具體數值，對于基因表達量而言是基因的拷貝數，不涉及任何比較。

相對定量首先需要確定一個內參基因，內參基因作用有檢測樣本材料中RNA是否降解、糾正樣本加樣的差異、校正cDNA合成速率差異及校正PCR抑制劑的影響，其本質作用是利用內參基因的Ct值對目的基因的Ct值進行均一化處理，常用的內參基因包括GAPDH、β-actin、18S rRNA，使用的時候需要注意其序列必須是物種本身的特異序列，雖然其比較保守，但不同物種也會存在堿基差別。另外，相對定量需要確定參照物，因為涉及比較，參照物選擇不同，所得的定量結果可能完全相反，經常選擇的參照物一般是對照組或未處理組。

相對定量實驗方法包括兩種重要方法：

ΔΔCT Method：使用內參基因定量所研究樣品和參照樣品的目的基因。內參基因與目的基因可以同時反應，也可以單獨反應；

雙標準曲線法：對每個樣品的內參基因和目的基因都做絕對定量，求出每個樣品中內參基因和目的基因的絕對數量，然后根據相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達。絕對定量需要由標準曲線建立Ct值跟拷貝數之間的關系，標準曲線由標準品生成，標準品可以是已知濃度的RNA、質粒或合成的寡核苷酸鏈生成，定量未知模板時標準樣品和未知樣品必須同時反應。

絕對定量首先需要建立Ct值和拷貝數之間的線性關系，即標準曲線，標曲需要由標準品生成，標準品中基因序列要與待測樣品中基因序列一致，從而保證引物在兩者中擴增效率完全相同，標準品來源可以是質粒，純化的PCR產物或者基因組DNA等。標準品在加樣時需要注意體積最好大于2微升，以減少標曲誤差，標曲是由不同梯度標準品生成，每個標準品梯度建立Ct值與拷貝數對數值之間的聯系，落在標曲上的梯度點最好有5個及以上，至少3個點。標準品和待測樣品同時反應，將待測樣品檢測的Ct值代入標曲后即可換算出待測樣品中基因的拷貝數。

說了這么多，不知道小伙伴們對qPCR的理解是不是清晰多了呢？qPCR作為一種簡單便捷的定量技術，應該是小伙伴們最最最常用的技術了。希望這篇文章能幫助小伙伴們從入門到精通，最終成為自己領域的大牛！