SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）是一種基于大小分離蛋白質的常用技術。通過使蛋白質變性并賦予其均勻的負電荷，在電場作用下蛋白質向正極遷移，根據大小進行分離。本文將詳細介紹SDS-PAGE凝膠的配制方法及常見問題和解決對策。

一、 SDS-PAGE凝膠配制
*注意事項：
丙烯酰胺和雙丙烯酰胺是神經毒素，操作時應佩戴適當的個人防護裝備。總體積通常為10 mL，但可以根據需要調整。
過硫酸銨（APS）作為引發劑，與TEMED一起使用可以加速聚合反應。
緩沖液的體積會根據丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的體積進行調整，以確保總體積的準確性。
這些配方是基于常用的分離膠濃度，具體實驗可能需要根據目標蛋白質的分子量范圍進行調整。

1. 分離膠配制
（1）配方表：
以下表格列出了不同濃度的分離膠的配方：

（2）配制步驟：
1. 清潔玻璃板和墊片：
? 使用去離子水和乙醇徹底清潔玻璃板和墊片，確保沒有殘留物。
2. 組裝玻璃板：
? 使用墊片將玻璃板組裝在穩定、均勻的表面上，確保組裝緊鎖夾子，檢查玻璃板完好性。
3. 配制分離膠溶液：
? 在干燥、干凈的燒杯中按照配方表中的比例混合水、30%丙烯酰胺、1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)、10% SDS、10% APS 和 TEMED。TEMED必須是最后 加入的成分。
? 攪拌均勻后，立即倒入組裝好的玻璃板中，確保均勻分布。
? 用水或異丙醇覆蓋凝膠表面，以保持均勻的表面，室溫下凝固約 20-30 分鐘。

2. 濃縮膠配制
（1）配方表：
以下表格列出了濃縮膠的配方：

（2）配制步驟：
1. 清潔玻璃板和墊片：
? 使用去離子水和乙醇徹底清潔玻璃板和墊片，確保沒有殘留物。
2. 組裝玻璃板：
? 使用墊片將玻璃板組裝在穩定、均勻的表面上，確保組裝緊鎖夾子，檢查玻璃板完好性。
3. 配制濃縮膠溶液：
? 在干燥、干凈的燒杯中按照配方表中的比例混合水、30%丙烯酰胺、0.5 M Tris-HCl (pH 6.8)、10% SDS、10% APS 和 TEMED。TEMED必須是最 后加入的成分。
? 攪拌均勻后，立即倒入組裝好的玻璃板中，確保均勻分布。
? 用水或異丙醇覆蓋凝膠表面，以保持均勻的表面，室溫下凝固約 20-30 分鐘。

二、 可能出現的問題及解決方案
在SDS-PAGE凝膠制備過程中，可能會遇到各種問題。以下是一些常見問題及其解決方案：

1. 漏膠問題：
? 原因：玻璃板未對齊或缺損，墊片密閉性不良。
? 解決方案：確保玻璃板干燥，對齊后緊鎖夾子，檢查玻璃板完好性。

2. 凝膠不凝固：
? 原因：APS或TEMED失效，操作不當。
? 解決方案：使用新鮮APS，確保TEMED未變質，避免膠未凝固前晃動。

3. 凝膠凝固不均勻：
? 原因：玻璃板未洗凈，試劑有沉淀，混合不均勻。
? 解決方案：徹底清洗玻璃板，確保試劑澄清透明，均勻混合組分。

4. 凝膠中有氣泡：
? 原因：膠墊材質問題，插梳子不當。
? 解決方案：使用實心軟膠墊或保鮮膜，正確插入梳子。

5. 上層膠邊緣缺損：
? 原因：玻璃板邊條密閉性不良。
? 解決方案：檢查并更換邊條，確保其密閉性。

6. 拔梳子后泳道有膠絲：
? 原因：TEMED 用量過多。
? 解決方案：減少TEMED用量，確保在插梳子前膠未部分凝固。

7. 拔梳子后泳道歪斜：
? 原因：梳子與玻璃板不匹配。
? 解決方案：確保梳子與玻璃板匹配，必要時更換。

8. 上層膠中電泳出現“漏樣”：
? 原因：玻璃板與膠局部分離，上樣緩沖液問題。
? 解決方案：小心取下玻璃板，避免分離，上樣時避免槍頭插得太深。

9. 泳道中心凹陷：
? 原因：梳子插入后膠暴露于空氣中時間過長。
? 解決方案：盡量在 25 分鐘內插入梳子，避免長時間暴露。

結語
通過詳細了解SDS-PAGE凝膠的配制方法及常見問題的解決方案，實驗者可以有效提高實驗成功率，減少誤操作，從而獲得高質量的實驗結果。一塊優質的SDS-PAGE膠能打好蛋白質電泳的基礎，從而跑出清晰好看的條帶，獲得優質的實驗結果。