蛋白-蛋白相互作用是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究中最重要的方面之一。今天我們來(lái)學(xué)習(xí)一個(gè)蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)——Pull-down實(shí)驗(yàn)，Pull-down實(shí)驗(yàn)，又稱(chēng)拉下實(shí)驗(yàn)，是一種體外親和純化技術(shù)，也是一種驗(yàn)證酵母雙雜系統(tǒng)的體外試驗(yàn)技術(shù)。蛋白Pull-down可用于驗(yàn)證已知蛋白或肽的相互作用，也可以用來(lái)篩選與已知蛋白或肽互作的未知蛋白或肽。但是在一定程度上不能真實(shí)反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)之間的相互作用，因?yàn)樵隗w外相互作用的蛋白質(zhì)在正常生理?xiàng)l件下不一定會(huì)相互結(jié)合。

一、GST Pull-down

Pull down技術(shù)是通過(guò)固定一種誘餌蛋白來(lái)特異性吸附配體蛋白，以達(dá)到富集、分離、純化某種配體蛋白的目的。為了更有效地利用Pull down技術(shù)，1988年，Smith等人利用GST融合標(biāo)簽從細(xì)菌中純化出GST融合蛋白（Smith et al., 1988），將已知蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)，親和固化在GSH親和樹(shù)脂上，作為一種“誘餌蛋白”去捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”（目的蛋白），洗脫結(jié)合物后通過(guò)SDS-PAGE電泳分析，從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白。

“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過(guò)細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得，這種方法簡(jiǎn)單易操作。

基本原理：

GST Pull-down的原理主要是利用GST對(duì)GSH的親和性，將GSH固定于瓊脂糖珠上，形成GSH-瓊脂糖珠，再通過(guò)DNA重組技術(shù)將已知蛋白X與GST融合，GST-X融合蛋白與GSH-瓊脂糖珠形成“瓊脂糖珠-GSH-GST-X”復(fù)合物，若環(huán)境中存在與X蛋白互作的蛋白Y，則會(huì)形成“瓊脂糖珠-GSH-GST-X-Y”復(fù)合物，與X蛋白互作的蛋白即可被分離并檢測(cè)。

操作步驟：

樣品處理—GST/His-誘餌蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建—GST融合蛋白表達(dá)—GST融合蛋白純化—Pull-down捕獲獵物蛋白—SDS-PAGE電泳—Western blot或LC-MS/MS

二、DNA Pull-down

DNA pull-down是一種新穎的體外研究DNA與蛋白互作的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。該技術(shù)以研究的DNA序列為探針，尋找與該序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，最常見(jiàn)的應(yīng)用是尋找某個(gè)或者某些特定基因啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子/組蛋白。

基本原理：

針對(duì)目標(biāo)區(qū)域體外制備脫硫生物素標(biāo)記的特異性DNA探針，使其與待測(cè)蛋白液孵育，可與偶聯(lián)在磁珠上的鏈霉親和素結(jié)合，形成“生物素化DNA-蛋白質(zhì)”復(fù)合物。生物素與鏈霉親和素間的作用是目前已知強(qiáng)度最高的非共價(jià)作用，采用鏈霉親和素磁珠將靶DNA及其結(jié)合蛋白從待測(cè)蛋白液中分離出來(lái)，洗滌后，將非特異性結(jié)合蛋白去除，最后，經(jīng)洗脫液洗脫，得到目的DNA探針-蛋白質(zhì)復(fù)合物，通過(guò)Western blot檢測(cè)洗脫液中是否有待測(cè)蛋白；通過(guò)LC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)靶DNA的潛在結(jié)合蛋白并鑒定蛋白質(zhì)類(lèi)型。

操作步驟：

樣品處理—探針標(biāo)記—蛋白與探針共孵育—Western blot或LC-MS/MS檢測(cè)

DNA Pull-down的優(yōu)點(diǎn):

1、可富集分析低豐度蛋白；

2、探針制備簡(jiǎn)便，周期短；

3、獲得特異性蛋白與下游蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)兼容。

DNA Pull-down的缺點(diǎn):

1、長(zhǎng)鏈探針往往存在非特異結(jié)合現(xiàn)象；

2、反應(yīng)條件要求無(wú)核酸酶；

3、體外實(shí)驗(yàn)，相對(duì)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)存在一定弊端。

三、RNA Pull-down

RNA涉及生命的所有領(lǐng)域，在許多基因表達(dá)過(guò)程、宿主防御機(jī)制、細(xì)胞增殖和疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的非編碼RNA被注釋出來(lái)，其廣泛的生物學(xué)功能也成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。RNA與蛋白質(zhì)的相互作用也是非編碼RNA發(fā)揮功能的主要作用機(jī)制之一，其中，RNA pull down是用于檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間互作的主要實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，也是近年來(lái)研究非編碼RNA（如IncRNA、circRNA）與蛋白質(zhì)相互作用及生物學(xué)功能驗(yàn)證的主要手段。

基本原理：

RNA Pull-down作為研究RNA與蛋白互作的核心技術(shù)，是使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，通過(guò)生物素與鏈霉親和素的非共價(jià)親和作用，使其與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，如果檢測(cè)蛋白為已知蛋白，可通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用；如果檢測(cè)未知蛋白，則可結(jié)合質(zhì)譜（MS）進(jìn)行鑒定特定RNA結(jié)合蛋白，以鑒定蛋白質(zhì)類(lèi)型。

操作步驟：

樣品預(yù)處理—生物素探針標(biāo)記RNA—RNA抽提—細(xì)胞裂解—磁珠富集RNA—RNA結(jié)合蛋白孵育—RNA結(jié)合蛋白洗脫—Western blot或LC-MS/MS檢測(cè)

RNA Pull-down的優(yōu)點(diǎn)：

1、可富集檢測(cè)低豐度RBPs-RNAs復(fù)合物；

2、體外直接轉(zhuǎn)錄目的RNA作為誘餌，避免了RNA互補(bǔ)探針導(dǎo)致的非特異性結(jié)果；

3、質(zhì)譜鑒定具有高效、通量大的特點(diǎn)，可一次性獲得可能與目的RNA互作的蛋白。

RNA Pull-down的缺點(diǎn)：

1、受磁珠的影響，不同的磁珠會(huì)產(chǎn)生不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

2、實(shí)驗(yàn)成本較高，應(yīng)用范圍有限；

3、只能檢測(cè)到蛋白和RNA結(jié)合，不能檢測(cè)到RNA和其他物質(zhì)結(jié)合，不能用來(lái)研究RNA的功能性相互作用。

參考文獻(xiàn)

Aranda S, E Borràs, E Sabidó, et al. Chromatin-Bound Proteome Profiling by Genome Capture[J]. STAR Protocols, 2020:100014.

Carmichael, Gordon G. [Methods in Molecular Biology] Regulatory Non-Coding RNAs Volume 1206 RNA Pulldown Protocol for In Vitro Detection and Identification of RNA-Associated Proteins[J]. 2015, 10.1007/978-1-4939-1369-5(Chapter 8):87-95.

Smith D B, Johnson K S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase[J]. Gene, 1988, 67(1):31-40.