十四、血清或培養基產生了顏色或沉淀的問題：

 1、問：我用的是四季青的胎牛血清，56℃30 分鐘滅活后出現了白色少量絮狀沉淀，是不是污染？還能不能再用？血清的生產日期是 2006 年 7 月 (現在是 2007 年 6 月 11 日)。 

 答：應該問題不大。你可以取少量血清放入培養皿中，37℃過夜培養看看就知道是否污染了。血清中沉淀物的出現有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白 (形成凝血的蛋白之一) 在血渭解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。若您欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內，以 400g 稍微離心，上清液即可接著加入培養基內一起過濾。 

 2、問：我用 MTT 法測細胞的增殖，用 DMSO 裂解細胞，發現把 DMSO 加入到孔中就會形成乳白色 (用的含胎牛血清的 1640 培養基，由于沒有離板子的離心機，所以沒有去除培養基直接加的 DMSO)。以前用含小牛血清的培養基沒有看到有這種情況。該怎么解決？ 答：為什么要用離心機離心呢？難倒你養的是懸浮細胞嗎？如果是貼壁細胞的話直接將 MTT 倒掉，再加 DMSO 即可，我們就是這么做的，效果很好！并且測細胞的增殖的話如果不去掉 MTT 就加 DMSO 的話誤差應該很大！有時不一定就是血清的原因，可能跟你的 MTT 放置的時間或以及其他成分有關！ 

 3、問：(1)GIBCO 胎牛血清 500ml，今天解凍后沒有混勻直接分裝，結果使得前面的幾管是清亮的，后面就帶有棕色的，不知有沒有影響？估計有什么影響？前面的成分好還是棕色的成分好啊？ 答：肯定有。最好還是重新混合重新分裝，我覺得有效成分會集中在棕顏色部分。 

 問：(2) 為什么會出現棕色呢？

 答：血清中的棕色多一些可能是因為紅蛋白的含量高些的緣故吧。

 問：(3) 血清滅活之后可以存放嗎？我的是前天滅活的，但是沒有加到培養基里，而是放在冰箱里，那下次可以直接用嗎？還是再次滅活啊？   

答：當然可以，如果多的話，分裝后最好放在－20℃，下次用時再解凍，也不用再滅活。最好用一管拿一管，少許血清可以放在 4℃。分裝時還要注意不要裝得太滿，以免溢出污染。

 十五、污染和過濾的問題。

 1、問：懷疑血清染菌，想用濾膜過濾一下，可否自己用 0.22μm 濾膜過濾？對血清性質有多大影響？有做過的么？ 

 答：可以過濾的，血清當出廠時都是 0.22μm 或 0.1μm 過濾除菌。想證明有沒有染菌不用過濾這么麻煩，只要放置于 37℃過夜就可以了，如果有微生物污染會變渾濁的，如果還是澄清的就說明沒有問題的。實驗室中血清很難直接過濾，一般要加到培養基中再過濾。我們實驗室制備培養基時，都使用濾膜過濾，一般而言如果制備 1-2 瓶培養基，一個濾膜及一支 30ml 注射器可以過濾 50ml 小牛血清。如果大量制備培養基也可以將血清加到培養基中，使用 0.22 微米的大濾膜一起過濾。 

2、問：我懷疑我用的完全 1640 培養液被污染了，準備重新過濾消毒，過濾后是否需要補充胎牛血清？如需又如何補充？ 

 答：完全 1640 培養液被污染了，如果是支原體的話，過濾沒有作用，支原體可以通過濾膜。我們用 1640 液，都是配液后保留 500ml，然后其他的分裝 100-200ml，現用現配因為血清比 1640 要貴，如果你想過濾的話，建議你加原比例血清，因為血清不會很容易通過濾膜。最主要的還是找到可能污染的原因。

3、問：加好了血清雙抗的培養基由于污染了再過濾后還能用嗎？ 

 答：建議不要用了。在加了雙抗的情況下已經污染，那么細菌污染的可能性會較小了。一般的過濾除不能去除病毒或者部分真菌的污染的。 

 4、問：我準備把使用的完全 1640 培養液重新過濾一遍，不知道培養液中的血清成分是否能通過濾膜，過濾后是否還需要補充胎牛血清？如需又如何補充？ 

 答：可以透過，但是隨著液體量的增多會很慢，如果不加壓會比較麻煩，還有最好用低蛋白吸附的，不然損失是比較大的。 

 十六、問：懸浮細胞培養時能否加血清？如果加了會有什么結果？為什么懸浮細胞培養時就不能加血清？ 

 答：血清是細胞培養基中重要的培養成份之一，對細胞生長有廣泛影響。在細胞培養時，我們通常會加入 10% 的血清。血清的質量對細胞培養的成功至關重要。一般說來，牛血清包括以下成分：生長因子 (如激素，白細胞介素等)，他們可以促進細胞生長；貼附因子，他們可以促進細胞的貼壁，往往只有細胞貼壁才能增值 (懸浮培養的細胞除外)；蛋白質 (如血清白蛋白，球蛋白等)，既可以作為營養物質，又可以中止胰酶的作用；還有很多成分不明的物質。血清還可以起到解毒作用，如脂肪酸、重金屬和某些蛋白酶的毒性。血清還可以是細胞免受機械損傷。因此，無論是貼壁細胞還是懸浮細胞，血清是必不可少的。除非因實驗要求無血清培養時，例如：為使細胞同步化時，我們會采用無血清培養的。單純的說懸浮細胞培養不能加血清就沒有太多的道理了。 

 十七、關于中和消化液需要的血清量。 問：用胰蛋白酶消化細胞后，需要用血清中和。具體這種中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之間的比例是多少？ 

 答：做了很久的試驗，真的沒有想過胰酶和血清的對應關系。不過細想下來，這個應該也沒有固定的比值。血清的品種都是不同的，成分必然有差異，如何能確定其與胰酶的比值關系？我們消化細胞的時候，如果是傳代，細胞變形后，吸出胰酶直接加入適量的 hanks 液或者全培，這個量看自己的喜好和吹打細胞方便而定。一般都可以中止消化的。不會存在繼續消化的事情。如果是從組織上消化細胞做原代培養，我一般都使用全培進行中止，而且加的很多，0.25% 的胰酶，用 10% 血清，按 1:2 的比例應該是足夠的。當然全培是 2，一般我養細胞的時候，會用國產的比較便宜的血清配制全培，專門用于中止消化，這樣有幾個好處：一是中止消化的效果應該好于 hanks 液吧，再是也有利于維持細胞活性。而且這部分液體會被離心去掉，血清便宜，離心掉了不會心疼。而養細胞的時候用好血清。個人觀點，僅供參考。

十八、血清中的懸浮物問題。 

 1、問：發現培養的細胞瓶中背景有許多的小黑點，培養液中也有一些漂浮的物。看了之前的帖以為是膠原蟲。本打算換液，換液前特意看了下前些天配的培養液，肉眼發現培養液中有懸浮的顆粒狀物質 (不多)，于是放在鏡下觀察，新鮮培養液中有一些懸浮的小顆粒，不多。(培養液是 R1640+20% 牛血清 +1% 雙抗) 于是又將分裝在 4℃保存的小牛血清拿出觀察，肉眼可見 5、6 個白色小小球狀的物質，在血清瓶稍靠下的部位懸浮。鏡下觀察，也有少量的不知什么物質的東西漂浮。小牛血清是 Hyclone 新西蘭的，標簽上寫已經經過 2μm 濾膜過濾處理。根據上述培養液的情況，是否說明培養液已被污染？如果是正常的血清是不是在鏡下不應該看到雜物，哪怕是極少量的？根據上述血清的描述，是不是說明血清也存在問題，還能用嗎？補充：細胞培養以來生長狀態就不好。買血清的時候廠家說明不用滅活，所以未滅活。

 答：(1) 血清應該 -20℃保存，解凍血清時，請按照的逐步解凍法 (-20℃至 4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大實驗顯示非常容易產生沉淀物。

        (2) 血清中沉淀物的出現有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白在血清解凍后，也會存在于血清中，亦可造成沉淀物。

       (3) 若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清，再放回冷凍，若存放于 4℃時，請勿超過一個月，儲存在 2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白，可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。 

       (4) 解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發生。

       (5) 排出了血清的原因，在考慮實驗用品和無菌操作的問題。

       (6) 細菌病毒、衣原體、黑膠蟲污染也很常見，如果細胞死的太多，影響較大建議更換培養液。

 2、問：今天在配培養液時，發現血清里面有小碎片樣的漂浮物，血清仍然清亮，不渾濁。不知道是什么，問了實驗室的學長，說仍然可以用，但還是不放心，沒有用血清。求助園子的各位達人，這可能是血清出了什么問題？我的血清用了一個月不到，四季青的。 

 答：可能的原因：

(1) 培養液配置時 Votex 不夠，當時是清亮的，但過一段時間會析出來；

(2) 真菌污染。 十九、更換無血清培養基后細胞大量死亡的問題。 問：我使用 Lipofectamine2000 轉染成骨細胞，在轉染前要換上無血清的培養基。本來條件模的好好的，轉染效率也可以接受。但是寒假一回來就發生了怪事：細胞在有血清的培養基中長的好好的，一換無血清的培養基就死亡。大概 4 個小時就能看到較多的細胞飄起來。但是原來我換無血清培養基，就算放那里 10 個小時都是沒問題的啊。已經換了不同批次的培養基，甚至吸管什么的都換過了，但是就是不行，是怎么回事？ 

 答：(1) 兩周后的培養液應補加谷氨酰胺，或者重新配液，轉染時應不含抗生素。

       (2) 確認操作方法和環境，建議檢查一下。

       (3)Lipofectamine2000，脂質體的毒性很大，如果有質粒參與對細胞損傷更大，如果 Lipofectamine2000 在常溫放置過，對細胞更大，假期冰箱是否斷過電。 

      (4) 培養箱的溫度、c02 濃度，濕度。 二十、完全培養液的相關定義。 問：“完全培養液一詞”，是指加了血清的培養液嗎？我在做含藥血清的實驗，涉及到血清添加量的問題。所以想弄明白文中所指的“完全培養液”是否是含藥血清。 答：原液是指配置后過濾除菌。不完全培養液是指不含有血清的原液，其他成分已補充。完全培養液是指不完全培養液加入血清后稱完全培養液。 二十一、血清相關知識總結。 使用胎牛血清的注意事項： 血清是細胞培養中最重要的元素之一。下面是實驗室里常會遇到的問題，僅供大家參考： 

 1、保存血清最好的方法： 建議血清應保存在 -5℃ 至 -2O ℃ 。然而，若存放于 4 ℃ 時，請勿超過一個月。若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清至恰當的滅菌容器內，再放回冷凍。 

 2、如何解凍血清才不會使產品質量受損： 建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于 2～8℃ 冰箱使之溶解，然后在室溫下使之全溶。但必須注意的是，溶解過程中必須規則地搖晃均勻。 

 3、血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現，該如何處理： 血清中沉淀物的出現有許多種原因，但最普的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白 (形成凝血的蛋白之一) 在血渭解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。 若您欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內，以 400g 稍微離心，上清液即可接著加入培養基內一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞您的過濾膜。 

 4、何謂熱滅活： 一般是以 56℃ ， 30 分鐘來處理已解凍的血清，因為此加熱步驟，可以使補體去活化，而補體所參與的反應有 : 溶細胞活性，平滑肌的收縮，肥大細胞和血小板組胺的釋放，增強吞噬作用，淋巴細胞、巨噬細胞的趨化和激活。 

 5、關于胎牛血清的滅活： 有必要做熱滅活嗎？ 實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。而經過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒立顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在 37℃ 環境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。 因此我們建議您，若非必須，您可以不需要做熱處理這一步。如此一來，不但節省您寶貴的時間，更確保您血清的質量！ 

 6、血清相關知識： 如何避免沉淀物的產生？

 我們建議您在使用血清的時候，注意下列的操作 :

 (1) 解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法 (-20℃至 4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大 (如 -20℃至 37℃)，實驗顯示非常容易產生沉淀物。 

 (2) 解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發生。 

 (3) 請勿將血清置于 37℃太久。若在 37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質量。 

 (4) 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

 (5) 若必須做血清的熱滅活，請遵守 56℃，30 分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。