一、原理

qPCR 技術通過引物特異性擴增目標 DNA 序列，并通過熒光探針或 SYBR Green I 熒光染料法檢測 PCR 產物的數(shù)量，來定量分析樣品中目標序列的數(shù)量。qPCR 技術具有快速、準確、高靈敏度和高特異性等優(yōu)點。

二、用途

廣泛應用于基因表達分析、突變檢測、病原體檢測等領域。

三、材料與儀器

1、試劑：
RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑、qRT-PCR 試劑盒、細胞炎性因子引物（探針法還需要一個探針）、PBS、DEPC 水等；
2、材料：
無 RNA 酶、EP 管及八連排 PCR 管、無 RNA 酶的槍頭等。

四、步驟

1、細胞培養(yǎng)：將待檢測的細胞接種在培養(yǎng)皿中，依據實驗目的處理細胞，待收集細胞時，用 PBS 輕柔清洗 2~3 次以去除培養(yǎng)基對后續(xù)試驗的干擾。
2、RNA 提取：使用 RNA 提取試劑盒，從細胞中提取總 RNA，并使用紫外分光光度計檢測 RNA 濃度和純度，A260/A280 在 1.8~2.1，表明 RNA 樣品可用。RNA 很不穩(wěn)定，易降解，建議測定完成后盡快進行反轉錄反應。
3、cDNA 合成：根據反轉錄試劑說明書分為兩步，一是去除基因組 DNA，二是反轉錄反應獲取 cDNA。此步驟完成后可將 cDNA 凍存于-80℃ 以備用。
4、qRT-PCR 反應：設計并合成引物，隨后以 cDNA 為模板，使用細胞炎性因子的特異性引物進行 qRT-PCR 擴增反應。反應完成后，確認擴增曲線和融解曲線，對標準曲線進行分析。
5、數(shù)據分析：使用 qRT-PCR 儀檢測熒光信號，導出 Ct 值，以β-actin 作為內參基因，采用 2-△△CT 法來計算細胞炎性因子的表達水平。

五、注意事項

1、RNA 提取：RNA 提取的質量和純度對于后續(xù)的 cDNA 合成和 qRT-PCR 檢測都非常關鍵。需要使用高質量的 RNA 提取試劑盒，并嚴格按照說明書操作。在提取 RNA 的過程中需要注意避免 RNA 的降解和污染。
2、cDNA 合成：cDNA 合成是將 RNA 轉錄成 cDNA 的過程，需要選擇適當?shù)哪孓D錄酶、引物和反應條件。在反轉錄前需要對 RNA 進行 DNA 酶消化，避免 DNA 污染影響后續(xù)的 qRT-PCR 檢測。
3、引物和熒光探針設計：對于細胞炎性因子的檢測，需要設計特異性的引物和熒光探針，以確保只擴增目標序列并減少假陽性的發(fā)生。可以使用在線工具（Primer3 等）設計合適的引物和熒光探針，也可以向商家購買。
4、若 SYBR Green 染料法，在 qPCR 反應體系中，需根據 PCR 儀器型號選擇是否加入 ROX 染料。
5、數(shù)據分析：qRT-PCR 檢測的結果需要通過數(shù)據分析軟件進行處理。需要注意數(shù)據的標準化和統(tǒng)計學分析。同時，需要對實驗結果進行驗證和重復實驗，以確保結果的可靠性。