1.      引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種, 主要都是由ABI/PE 公司生產，而Bioneer自行研制的專利384并行高通量DNA合成儀，可實現99%的高合成率。無論采用什么機器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環用時的多少。

亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接。

第一步是將預先連接在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5′-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5′-羥基。

第二步，合成DNA的原料，亞磷酰胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3′端被活化，5′-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5′-羥基發生縮合反應。

第三步，帶帽(capping)反應，縮合反應中可能有極少數5′-羥基沒有參加反應(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續發生反應，這種短片段可以在純化時分離掉。

第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉變為更穩定的磷酸三酯。

經過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5′-羥基上的保護基團DMT，重復以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。

通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPC, PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮、脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測定OD260定量，根據定單要求分裝。

2.引物純化方式有哪些，如何選擇？

◆　脫鹽

寡核苷酸合成后，為了純化寡核苷酸成為天然的DNA結構，首先必須去除保護基團。通過濃氨水處理，合成的寡核苷酸從固相載體上分離，2-氰乙氧基--磷酸二脂鍵的保護基團，以及堿基的保護基團基（苯甲酰基和異丁基）被去除，從而形成了天然的DNA結構。然而，必要的去保護步驟完成后，寡核苷酸混合物還包含幾種必須被去除的小分子有機化合物。所有非必須有機化合物被移除的過程通常叫做脫鹽。脫鹽純化可以借助反向硅膠柱進行。盡管脫鹽純化可以移除所有的非必須有機雜質，但它不能有效移除合成中產生微量的提前終止的寡核苷酸雜鏈。然而，脫鹽的寡核苷酸還是能夠滿足ＰＣＲ檢測等基礎生物研究。

◆　BioRP / OPC純化

如果寡核苷酸以“三苯甲基”的形式合成，則N-甲基寡核苷酸包含5’-DMT基團，提前終止的寡核苷酸不包含該基團。因為DMT基有強的親脂的特性，有5’-DMT基團的寡核苷酸與反相樹脂有親和性，因此反相親和樹脂通常被用于寡核苷酸的純化。利用反向樹脂和5’－DMT寡核苷酸存在強親和力，但是提前終止的寡核苷酸不包含DMT基團，所以，我們能夠成功的把想要的N-甲基寡核苷酸從提前終止的寡核苷酸雜質中分離出來。

◆　HPLC

如果合成的寡核苷酸應用于克隆，定向誘變或定量的基因探測，那么對其純度要求較高。脫鹽或OPC純化的寡核苷酸可能達不到要求，則HPLC純化被廣泛地用于這個目的。作為一種純化樹脂，陰離子交換樹脂或反向樹脂被用于寡核苷酸純化。陰離子交換樹脂的HPLC通常顯示95-98%純化效率，對于達到35-mer寡核苷酸的純化是充分的。反向樹脂化的HPLC與陰離子交換樹脂的HPLC呈現相似的純化效率。因為HPLC的純化效率很大程度依靠寡核苷酸的長度，用HPLC法不能有效純化長的寡核苷酸（大于35-mer)。

◆　PAGE

對于長的寡核苷酸的純化（50-100mer），我們推薦PAGE純化法，它使用交連的聚丙烯酰胺凝膠(電泳)作為純化基質。盡管PAGE顯示出高的純化效率（＞98%），但它在額外的步驟方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脫鹽，繼而將導致純化產率的下降。

3.引物的OD數如何定量？

答：引物合成引物OD數是這樣測定的：用紫外分光光度計，波長260nm，石英比色杯，光程為1厘米，測定溶液的光密度。測定時溶液的光密度最好稀釋到0.2-1.0之間。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，用1ml水稀釋測OD值。需要根據稀釋倍數換算出母液的OD值。

4.需要什么級別的引物？

答：引物常用的純化方式脫鹽、BioRP / OPC純化、PAGE純化、HPLC純化。根據實驗需要，確定訂購引物的純度級別。

5.最長可以合成多長的引物？

答：引物越長，出現問題的概率就越大。有的公司合成過120base的引物，產率很低。除非需要，建議合成片段長度不要超過80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗產品，全長（還不一定正確）引物的百分比不會超過40%，后續處理還有丟失很多，最后的產量很低。

6.需要合成多少OD數？

答：根據實驗目的確定。一般PCR擴增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標準PCR反應。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要5-10 OD。做全基因構建的引物都比較長，但是我們有些研究人員也要求高OD數。片段越長, 最后全長得率就越低，出錯的幾率就越大。超出需要之外的OD數要求，其實也是對社會資源的一種浪費，同時也從一個側面反映了部分研究人員特別是新手的自信心不足，總覺得需要重復多次才能成功。

7.如何檢測引物的純度？

答：實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間后(約2-3小時)，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB 染色或銀染方式染色。

而有的廠家提供Maldi-TOF質譜QC質量控制，從而保障了合成的準確率：

Bioneer使用多重Maldi-TOF質譜儀進行全自動裝載及監測。 每份樣品的質譜分析數據將自動插入到寡核苷酸的信息單中。Bioneer是世界上僅有的幾個對生產的每份核苷酸 (單個寡核苷酸和高通量和成) 都用MALDI-TOF質譜儀檢測進行核苷酸QC檢測的廠商，而且免費提供質譜數據。

8.如何計算引物的濃度？

答：引物保存在高濃度的狀況下比較穩定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 一般情況下，建議將引物的濃度配制成50pmol/ul，加水的體積（微升）按下列方式計算：V (微升)= OD數*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以從合成報告單上獲得。如果需要配制成其他濃度，按上述公式換算。

注意：1 OD260= 33 ug/ml.

9.如何計算引物的Tm值？

答：引物設計軟件都可以給出Tm，與引物長度、堿基組成、引物使用緩沖的離子強度有關。

長度為25mer以下的引物，Tm計算公式為：

Tm =            4℃   (G + C)+            2℃   (A + T)

對于更長的寡聚核苷酸，Tm計算公式為：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) - 600/size

公式中，Size = 引物長度。

Tm的定義：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.

10.引物（含修飾）的分子量是如何確定的？

答：非修飾的引物的Molecular Weight在隨引物提供的報告單上都有明確的標示。如果需要估計一個引物的分子量按每個堿基的平均分子量為324.5，引物的分子量=堿基數 x 堿基的平均分子量。或按下列公式計算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（Nx * Wx）+( Ni* Wi) +16* Ns- 62.

NA, NG, NC, NT, Ni分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數量，WA, WC, WG, W, Wi分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分別為修飾基團的數目和分子量。

對于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數，例如G+A混合的分子量為（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns為硫代數目，硫代每個位置增加分子量16。

常規堿基分子量：

常規修飾基團分子量

11.如何溶解引物？

答：干燥后的引物質地非常疏松，開蓋前最好離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據計算出的體積加入去離子無菌水或            10mM Tris pH7.5緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩定。

12.如何保存引物？

答：引物合成后，經過一系列處理和純化步驟，旋轉干燥而成片狀物質。引物在溶解前，室溫狀態下可以長期保存。溶解后的引物-20度可以長期保存。如果對實驗的重復性要求較高，合成的OD數較大，建議分裝，避免反復凍融。修飾熒光引物需要避光保存。

13.合成的引物5'端是否有磷酸化

答：合成的引物            5'    為羥基，沒有磷酸基團。如果需要您可以用多核苷酸激酶進行5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成時直接在5′或3′端進行磷酸化，需要另外收費。

14.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？

連接反應需要引物的            5’磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對稱結構，退火的難度較大，退火時需要提高退火溫度。

15.測序發現引物有突變是怎么回事？

答：測序發現引物區域有突變，特別是40個堿基以下的引物, 發生的概率不大，但是肯定也會發生。用戶一般可以放心，引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列COPY到合成儀的，堿基輸錯的機會不多。核酸合成公司一般會有一套控制辦法，預防堿基輸入錯誤。發生這種突變的原因有很多解釋，人們還沒有辦法徹底解決這個問題。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機器也基本相同，合成主要原料都是由可數的幾家跨國公司提供的，所有每個合成服務商遇到的問題也基本類似，沒有人可以超脫。

引物合成是一種多步驟的化學反應，合成效率最高也就是99%，副產品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復，一般認為，偶連過程中，正在偶連的部分單體發生丟失DMT,導致單體又接了上去，故發生插入同一堿基的突變。至于缺失突變，一般認為是一般認為是帶帽(capping)反應不徹底造成的，Caping反應主要是封閉極少數5′-羥基沒有參加反應單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時將不能繼續參與合成。對于堿基置換的突變，產生的原因一般認為是堿基不能100%脫保護，即引物上可能含有殘留保護基團，引物的這些區域不能很好地與互補鏈配對，當擴增的產品被亞克隆轉化到大腸桿菌中，可能被細菌中修復系統補上了非配對的堿基。置換突變通常發生在G 轉換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉化為烯醇異構體 （脫嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA復制和擴增過程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A，測序就會發現堿基G-A置換。脫嘌呤現象在富含嘌呤的引物中發生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物后處理脫保護階段如果被降解，測序就會發現堿基G或A的缺失。

引物合成過程中，造成堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀存在，有不少降低發生的頻率建議和措施，但是這些措施還停留在實驗室階段，還沒有能夠應用到規模化生產中。

16.長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？

答：引物合成時，每一步反應效率都不能達到100%，產生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴增，不可能絕對保證擴增產物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴增過程所產生的頻率都要高。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。

17.如果測序發現突變，該如何處理？

答：遇到這種情況，首先和核酸合成廠家取得聯系，生產人員會檢查生產的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，他們在電腦中一般會保留所有原始數據。在確認引物合成序列沒有輸錯的情況下，建議重新挑取克隆測序，可能會找到正確克隆的。根據經驗，40個堿基以下的引物，測1-2個克隆就可以了；40個以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個克隆突變的位點都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費重合一次，不過重合的引物和第一次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率。基因拼接過程中，如果發現一段區域突變點不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。

18.引物是經過PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？

答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區分引物之間一個堿基的差別。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時，很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。國內有一個不好的現象，PAGE純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，導致割的條帶有時可能比較寬。建議：您如果減少OD數，引物遇到的問題可能就會少一些。

19. TaqMan 探針設計的基本原則是什么？

答：下列原則供您參考。
◆TaqMan 探針位置盡可能靠近擴增引物（擴增產物50-150bp），但不能與引物重疊。
◆長度一般為18-40mer 。
◆G-C含量控制在40-80%左右。
◆避免連續相同堿基的出現，特別是要避免GGGG或更多G出現。
◆在引物的5'端避免使用G。
◆選用比較多的堿基C。
◆退火溫度Tm控制在 68-            70C   左右。

有用的熒光染料參數

20.Primer設計的基本原則是什么？

答：引物設計的下列原則供您參考。
◆引物長度一般在18-35mer。
◆G-C含量控制在40-60%左右。
◆避免近          3'    端有酶切位點或發夾結構。
◆如果可能避免在          3'   端最后5個堿基有2個以上的G或C。
◆如果可能避免在            3'    端最后1個堿基為A。
◆避免連續相同堿基的出現，特別是要避免GGGG或更多G出現。
◆退火溫度Tm控制在 58-            60C    左右。
◆如果是設計點突變引物，突變點應盡可能在引物的中間。

21.為什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？

答：引物應該全是DNA，但是OD260/OD280的比值為什么那么低，怎么會有蛋白質污染？引物化學合成，哪里有機會污染到蛋白質？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由于引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個20mer 同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關。

A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions

22.同樣的OD用PAGE檢測，EB染色為什么深淺不一？

答：通常可以用EB染色的方法來判斷雙鏈DNA的量(如質粒DNA)，因為EB可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA，由于堿基組成不同，形成二級結構的可能性不同，EB的染色程度也會有差異，比如Oligo(dT)等不形成二級結構，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來定量，而用紫外分光光度計檢測。同樣道理，用EB染色來照片不適合所有引物。

23.引物不純會有什么后果？

答：引物不純可能會導致：1)非特異性擴增；2)無法用預先設計在引物5′端酶切位點的酶切開，特別是沒有保護堿基的引物；3) 用于測序出現雙峰或亂峰。解決辦法重新合成或重新純化。

24.已經溶解的引物，為什么原先使用正常，而過一段時間再使用就不好了？

答：如果溶解引物的水PH過低或污染了菌或核酸酶，會使引物降解。使用時沒有充分解凍混合，液體不均勻也可能會造成引物加入量不準確。建議分裝引物，避免反復凍溶。建議使用10mMT ris pH7.5緩沖液溶解引物，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）, 引物在這種條件下不穩定。還有一種可能性是引物沒有問題，而是PCR使用材料特別是模板的質量與先前使用的不完全一致。

25.PCR擴增不出就引物有問題嗎？

答：基本不是。當今發展出各色各樣的PCR擴增技術，各色各樣的高溫聚合酶，就是來解決PCR擴增中遇到的擴不出、擴增效率低的問題。如巢式PCR就是擴增那些拷貝數很低的基因片段。 有些重復片段的擴增, GC含量高的片段，非要采用特殊擴增手段才能擴增出了。

引物擴增不出，主要是下列兩種情況比較常見：

（1） RT-PCR。請注意，很多基因通過常規RT -PCR方法是很難擴增出來的。 RT- PCR成功的關鍵在于RT的反應的RNA質量和目標基因在特定組織和細胞中含量。

（2）從基因組中擴增。一般情況下，基因在基因組中都是單拷貝，基因組作為模板需要嚴格控制用量。基因組DNA過高，會影響反應體系中的Mg和pH