最近在不同技術(shù)論壇上溜達加上客戶的來電咨詢，發(fā)現(xiàn) Co-IP 免疫共沉淀的實驗小伙伴做得并不是很順利，遇到的問題也是千奇百怪，有什么條帶也沒有檢測到的，有泳道一片漆黑的，有出了條帶但位置大小還不對，真是讓小伙伴們傷透了腦筋，萬變不離其蹤，做實驗之前我們先系統(tǒng)地的了解一下實驗各個環(huán)節(jié)的一些基本概念和注意事項，以及如何設置完整的對照以便出問題時快速分析原因。免疫共沉淀實驗原理介紹： 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation），簡稱 Co-IP，其原理是當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來, 如果用蛋白質(zhì) X 的抗體 anti-X（通常稱為 IP 抗體）將 X 特異地抓住并沉淀下來，那么與 X 在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì) Y 或者 Z 等也能共同被沉淀下來。

目前多用 protein A 或 G 預先固化在瓊脂糖或者磁珠 beads 上，protein A 或 G 可以結(jié)合各種抗體，具有通用性，當然它們結(jié)合不同種屬來源的抗體的親和力有差異,比如 Protein A 結(jié)合兔抗的結(jié)合力比 G 稍強, 具體需參考產(chǎn)品的說明書。 因此利用 Co-IP 實驗有以下作用： （1）測定兩種甚至更多種蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合； （2）鑒定一種特定蛋白質(zhì)的作用搭檔； （3）分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。不同材質(zhì)的 Beads： 　　 早期的產(chǎn)品 beads 是采用瓊脂糖做成的微球，通過離心沉淀到管底，因顆粒小容易被攪動起來，因此在 wash 的步驟移液動作要非常小心，不能吸走了 beads 也不能殘留太多的液體，否則靶蛋白有損失或者殘留液體可能導致假陽性信號。

而且瓊脂糖的beads 為多孔結(jié)構(gòu)在長時間的孵育過程中也會有各種蛋白質(zhì)進入到孔隙中在最后洗脫時都被煮出來了而導致背景不干凈，逐漸新的材質(zhì)磁性 beads 就誕生了，磁珠采用磁力架沉淀，沉淀清洗方便又快速，所以越來越多的實驗室采用 Co-IP 磁珠, 如 Bio-Rad SurebeadsTM。 實驗對照的設置： 一個成功的 Co-IP 實驗，首先得證明靶蛋白 X 和預測的相互作用的蛋白 Y 存在于蛋白質(zhì)樣品中，所以抽出來的蛋白樣品要直接檢測一下 X 和 Y 的存在，這個一般稱為 Input。 然后要證明 IP 抗體是不是能拉下來靶蛋白，做完IP后要檢測一下靶蛋白，這里要特別注意了，很多實驗室用western的一抗作為 IP 抗體，覺得 WB 能行IP也一定能抓住靶蛋白，這可是不一定的，因為 western 檢測時靶蛋白是變性的狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)都打開了。

很多抗體在制備時使用的是合成的肽段作為抗原，這樣的抗體不一定能識別非變性狀態(tài)下折疊起來的靶蛋白，只有實驗驗證后才知道是否能用于 IP 實驗，所以選 IP 抗體時一定要注意抗體的介紹上提到的 application，可能會有 ChIP, Flow Cyt, ICC/IF, IHC-P, IP, WB 等，而且即使購買的抗體說是可以用于 IP 的，其在不同樣品中的效果還是自己檢測了才知道， 如果靶蛋白沒有出現(xiàn)，就不必急著檢測 Y 了，先分析原因，要么 IP 抗體有問題，這個就要換不同的抗體試了，要么 beads 沒有結(jié)合上 IP 抗體，這個倒是可以通過 WB 來檢測是否包被好。 當然如果直接做內(nèi)源性 Co-IP，就怕 Input 也沒有出來，這樣就搞不清楚是不是樣品本身靶蛋白含量太低或者蛋白抽提沒有做好的原因， 遇到這種情況，我只能建議步子小一點，先做過表達的 Co-IP 吧。 IP 后 X，Y 蛋白都能檢測到，固然是值得高興的，但是這結(jié)果是不是假陽性呢？還得做個陰性對照，目前看到文獻中提到有四種方法： （1）只加入 beads 不加入 IP 抗體 （2）加入一種不相干的蛋白的抗體作為 IP 抗體 （3）加入正常 IgG 作為 IP 抗體 （4）使用不表達靶蛋白 X 但表達 Y 的蛋白樣品做對照。 只有以上對照都放了，出來的結(jié)果才是可以去解釋的。美美的圖片是像這樣的：

IP 指的是使用這個蛋白的抗體來包被 beads，IB 指使用某抗體去檢測沉淀下來的蛋白

這里的 IgG 就是做陰性對照用

影響 Co-IP 結(jié)果成敗的其它因素：除了以上這些在實驗設計時需要注意的，蛋白樣品的表達，抽提，Co-IP 的 wash 和洗脫步驟也是相當重要的，敬請期待后續(xù)報道。