免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry, ICC) – 是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來(lái)確定細(xì)胞內(nèi)抗原的成分(主要是多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱(chēng)為～。 (一) 對(duì)抗原和抗體的要求 ¨ 具有特異性高和親和力強(qiáng)的抗體是實(shí)驗(yàn)成功的首要條件。 – 對(duì)抗體的要求：純度高、比活性強(qiáng)； ¨ 高度特異性抗體的獲得，取決于抗原的純度。 – 對(duì)抗原的要求：純度高，免疫原性強(qiáng)，穩(wěn)定無(wú)變化。 (二) 抗原 (antigen, Ag) ¨ 抗原的概念：凡是在機(jī)體內(nèi)引起體液免疫和(或)細(xì)胞免疫反應(yīng)的物質(zhì)，稱(chēng)為抗原。抗原具有兩個(gè)方面的特性： – 免疫原性：引起機(jī)體產(chǎn)生抗體和(或)致敏淋細(xì)胞的特性； – 免疫反應(yīng)性：抗原能與相應(yīng)的抗體及致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異的結(jié)合或反應(yīng)的特性。 ¨ 根據(jù)抗原是否顯示免疫原性分為： – 完全抗原：分子量較大，一般在10kDa以上，并具有較復(fù)雜的化學(xué)組成。 • 免疫原性最強(qiáng)的是蛋白質(zhì)抗原，多糖次之；脂類(lèi)和核酸必需和蛋白質(zhì)及多糖形成復(fù)合物才具有良好的免疫原性。 – 半抗原：又稱(chēng)為不完全抗原，分子量較小。例如：某些短肽、多糖、類(lèi)脂和藥物等。 • 半抗原必需與載體結(jié)合，才能獲得免疫原性。 載 體 ¨ 通常是具有高度免疫原性的大分子物質(zhì)，具有將免疫原性傳遞給耦聯(lián)的半抗原能力。 – 常用的載體有鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。 – 用戊二醛或碳化二亞胺作為交聯(lián)劑通過(guò)功能基團(tuán)-NH 2 、-COOH等將半抗原結(jié)合到載體上。結(jié)合比例為5kDa結(jié)合5～25個(gè)分子的小肽。 （三）抗體 (antibody, Ab) 1、抗體的概念： ¨ 機(jī)體受到抗原刺激后，由漿細(xì)胞合成并分泌出一類(lèi)具有與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白，被稱(chēng)為抗體。 – 抗體主要存在于血清內(nèi)； – 抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗體。 – 免疫球蛋白根據(jù)重鏈的結(jié)構(gòu)及抗原特異性不同分為五種，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。 2、免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體：?jiǎn)慰寺】贵w和多克隆抗體。 ¨ 單克隆抗體：是一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，是應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備的。 – 特異性強(qiáng)、抗體產(chǎn)量高。 ¨ 多克隆抗體：是將純化后的抗原直接免疫動(dòng)物后，從動(dòng)物血中所獲得的免疫血清，是多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。 – 特異性低，會(huì)產(chǎn)生抗體的交叉反應(yīng)。 – 多克隆抗體廣泛應(yīng)用于石蠟包埋組織切片，可減少假陰性染色機(jī)會(huì)。 – 抗原與抗體的結(jié)合，要求量保持一定比例，當(dāng)抗原或抗體過(guò)量時(shí)，是不能聚合成大顆粒。 3、抗體的制備——多克隆抗體的制備 ¨ 動(dòng)物的選擇   ¨ 佐劑(adjuvant) ¨ 免疫方法 ¨ 免疫劑量 ¨ 抗體效價(jià)的測(cè)定 ¨ 放血或定期抽血 (1) 動(dòng)物的選擇 選擇什么動(dòng)物來(lái)免疫取決于： ¨ 所需抗血清的量 – 小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供幾升。 ¨ 能供免疫用的抗原量 – 小鼠50mg足夠，而山羊需要幾毫克。 (1) 動(dòng)物的選擇(續(xù)) ¨ 動(dòng)物的品系：免疫動(dòng)物與提供抗原的動(dòng)物之間的種系差異越大越好。 – 例如哺乳動(dòng)物的抗原可選擇非哺乳動(dòng)物來(lái)制備抗體。 – 常用的動(dòng)物有兔、羊、馬、豬等，以兔(新西蘭兔，年輕，健壯，體重在2.5kg左右，雄性)為最常用。