在單克隆抗體的特異性得到充分驗證之前，應該對所有候選的雜交瘤進行建系。但為了減少不必要的工作量，可以選擇其中20 個最佳的候選孔。在檢測這20 個孔的培養上清為陽性后，應該將這些孔的細胞進行凍存，同時進行有限稀釋。

附加材料

• 生長的雜交瘤

• 克隆和擴增用培養基

• 24 孔板

• 4ml 有蓋試管，無菌

步驟

1. 當96 孔板中生長的雜交瘤長到2 5%~50 ％匯合時（主要孔），用無菌的移液器（調節為100μl 的微量移液器）將主要孔中的細胞重懸，并將孔中全部內容物轉入24 孔板的—個孔，保證有足量的細胞在此擴增孔中擴增。若是從一個長有成纖維細胞的孔中轉移細胞，應該盡早進行轉移操作，以免成纖維細胞過度生長，并且操作時切忌刮到孔底（這樣做會松動成纖維細胞） 。

2. 用1ml 移液器在主要孔中滴入3 滴添加10 mmol/L HEPES 和1mmol/L 丙酮酸鈉的 DMEM-20 完全培養液，放回CO₂ 培養箱培養。

3. 用干凈的移液器取1~1. 5ml 用于克隆和擴增的培養基加入24 孔板， CO₂培養箱培養2~3d 。主要孔與擴增孔要用不同的移液器從不同的試劑瓶中取用培養基。

4. 當24 孔板中的細胞長到 25 %~50 ％ 匯合時(2 ~3 d ) ， 用有限稀釋技術進行克隆操作 。而當主要孔中的細胞長到2 5%~50 ％匯合時，必要時可重復步驟1~3 。

5. 完成有限稀釋操作之后，將24 孔板中多余的細胞移入4ml 無菌有蓋試管中。用添加 HEPES 和丙酮酸鈉的DMEM-20 完全培養液繼續培養24 孔板中的細胞。

6. 將前述4ml 管于室溫， 500g 離心5min 。將上清保留以備進一步抗體鑒定或作為對照。凍存細胞沉淀 。如果已確定建立了穩定的細胞克隆，那么細胞建系就完成了 ，將其凍存，并確保可被順利復蘇。

7. 如果有限稀釋操作不能培養出有抗體分泌活性的細胞系，則復蘇那些之前從24 孔板中分離的細胞。將其重新在24 孔板中培養，過夜，并用這些細胞重新建立有限稀釋孔板。將其凍存并妥善保存。