PCR

PCR是很多科研者進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室做的第一個(gè)分子實(shí)驗(yàn)，名字聽起來很高級(jí)，其實(shí)操作起來流程還是比較清晰明了，容易上手。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction），簡(jiǎn)稱PCR，用于放大特定的DNA片段，也可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。其中使用的Taq酶是1976年從溫泉中的細(xì)菌分離出來的。它的特性在于能耐高溫，是一個(gè)很理想的酶。PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復(fù)復(fù)制，而后隨著Mullis提出新的應(yīng)用，PCR技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性–退火–延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板–引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性–退火–延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。

RT-PCR

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)大概是我們接觸到的第二個(gè)PCR技術(shù)。原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。

相對(duì)PCR來說，這個(gè)實(shí)驗(yàn)主要是增加了模板的獲取過程。操作SOP按照說明書即可。

這個(gè)實(shí)驗(yàn)需要的注意事項(xiàng)：

1. 在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。

2. 為了防止非特異性擴(kuò)增，需要設(shè)陰性對(duì)照。

3. 內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。

4. PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定。

5. 防止DNA的污染：①采用DNA酶處理RNA樣品；②在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。

qRT-PCR

實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR）則可能是我們接觸的第三個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)。無論是剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的新手還是已經(jīng)操作多年的老手，都時(shí)不時(shí)需要用這個(gè)技術(shù)來進(jìn)行基因表達(dá)情況測(cè)定、轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)、突變體基因的鑒定、組織差異性表達(dá)等。對(duì)于熟練的師兄師姐，可能帶著耳機(jī)，在有節(jié)奏的槍頭吸打聲中就做出了完美的曲線。但是大部分第一次做這個(gè)實(shí)驗(yàn)的人，面對(duì)的可能是滿屏黃標(biāo)，而且并不清楚這些值代表什么，為什么會(huì)有這樣的結(jié)果。

實(shí)際上，在做qRT-PCR之前，我們第一個(gè)需要確定的是內(nèi)參基因，根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)材料和檢測(cè)的基因選擇好適合的內(nèi)參基因后。開始為自己的片段設(shè)計(jì)引物。

與目的基因在內(nèi)的所有引物Tm值不應(yīng)相差兩度。擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度以200-300 bp為宜。除此之外，還需要注意以下法則：1）用于突變體的基因表達(dá)量鑒定時(shí)，引物最好設(shè)在兩個(gè)外顯子之間，橫跨中間的內(nèi)含子，這樣可以避免DNA的污染；2）用于過表達(dá)基因表達(dá)量時(shí)，需找出該家族所有同源基因并進(jìn)行比對(duì)，并在保守性最差的區(qū)域設(shè)計(jì)引物；3）用于標(biāo)記基因檢測(cè)的引物序列最好來自發(fā)表的文獻(xiàn)。

最后值得注意的是，引物用完后需放入-20℃保存。盡量避免反復(fù)凍融，如果多次使用可在第一次溶解好后進(jìn)行分裝。如果在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)以前能擴(kuò)增的基因擴(kuò)不出的現(xiàn)象，多半是引物降解或部分降解導(dǎo)致的。在實(shí)驗(yàn)期間引物解凍后需用渦旋混勻，離心待用。

最后附一些實(shí)用的qRT-PCR體系配置技巧：

1）一定要在冰上配置體系；

2）所有的槍頭和PCR板都用進(jìn)口的，滅菌的；

3）盡量用同一槍頭完成樣品分裝，并且把控每次按壓槍的位置標(biāo)準(zhǔn)；

4）模版加在管壁上，避免槍頭離開時(shí)抽吸液體，最后離心。

腫瘤中激活的T細(xì)胞，控制腫瘤生長(zhǎng)等，期待這些研究的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)和應(yīng)用。