如何將膠內物質轉移到膜上?
凝膠是厚而易碎的基質,這使得操作與溫浴都很困難。如果要對膠內的內容物進行雜交,必須將內容物從凝膠引導到硝酸纖維素膜或者尼龍膜上。這一過程稱為轉移。
轉移之后,濾膜與一個探針溫浴,觀察探針是否能與濾膜上的分子雜交。探針由放射性元素或者其他指示劑標記,所以可以被檢測。濾膜與探針的雜交稱為印跡。
第一次使用印跡技術是由Southern 描述的, 因此, 這種印跡被稱為Southern 印跡。
不同種類的模板與探針的使用有不同的名稱。
Southern 印跡:濾膜上的DNA 由DNA 探測。
Northern 印跡:濾膜上的RNA 由DNA 或者RNA 探測。
Western 印跡:濾膜上的蛋白質由抗體探測。
Southwestern 印跡:濾膜上的DNA 由蛋白質探測。
Middle eastern 印跡: Poly (U) 來源的濾膜由mRNA 探測。
生物材料由凝膠轉移到濾紙或膜上有三種方法:
毛細管轉移:用千DNA 和RNA 。
真空轉移:用于DNA 和RNA 。
電泳轉移:用于DNA 、RNA 和蛋白質。主要有兩種裝置來做印跡,都是利用電流來驅動分子向陽極方向轉移到膜上。分別是干式轉膜儀或半干式轉膜儀(電流是由浸在陽極與陰極轉移緩沖液中的濾紙來攜帶的)和濕式轉膜儀(其中凝膠與膜都浸在轉移緩沖液中) 。電泳轉移需要能輸出高電流的電源裝置。
*濾膜
市售的膜有整卷的或大小預先裁剪好的兩種。除非實驗室每個人使用同樣大小的凝膠,否則購買整卷的。
裁剪或移動任何濾膜的時候要戴好手套。手指上的油脂會阻礙轉移。
用干凈的平頭攝子夾取濾膜。鋒利或尖的攝子會戳壞濾膜。
轉移用膜的選擇主要是尼龍(種類繁多)和硝酸纖維素膜(普通型或者易于操作的乙酸纖維索增強型) 。
尼龍膜最適合核酸。耐用、與核酸結合能力強、膜上物質可以脫去而用于多次雜交。尼龍往往染色背景較深,因此雜交過程中需要高濃度的封閉液。陽離子化的尼龍膜最適宜核酸,因為與核酸的結合并不依賴于緩沖液的離子強度。核酸不能通過電泳轉移到硝酸纖維素膜上。
硝酸纖維素膜最適合某些蛋白質, 而尼龍膜最適合于另一些。尼龍通常有更強的結合能力,但是有些蛋白質根本不結合。如果不得不使用硝酸纖維素膜,使用增強型的硝酸纖維素膜。可以嘗試一下PVDF ( 聚偏二征乙烯) 尼龍膜。硝酸纖維素膜和尼龍膜的實驗方案很不一樣。實際上,不同類型的尼龍有不同的實驗方案。
一般不需要擔心孔的大小, 0.45μm 是標準。較小孔徑的濾膜可以用于專門用途。
