雙脫氧法或酶法利用DNA 聚合酶合成單鏈DNA 模板的互補拷貝，這一方法最先由F. Sanger 及其合作者發(fā)展而來。DNA 聚合酶不能起始DNA 鏈的合成，而是在復(fù)性于“模板“DNA 的引物的3 ‘端上進行鏈的延伸（圖1) 。鏈的延伸是在引物生長端的3′ 羥基摻入脫氧核糖核苷酸。雙脫氧測序法利用了DNA 聚合酶能以2′, 3’－雙脫氧核糖核苷酸(ddNTP) 為底物的特性。當(dāng)ddNTP 被摻入到延伸著的引物的3′ 端時，由于鏈上3′ 羥基的缺乏，鏈的延伸就會終止。在4 個測序反應(yīng)的每個反應(yīng)中加入4 種可能的ddNTP 中的一種，即可產(chǎn)生4 種不同的反應(yīng)。調(diào)整每個測序反應(yīng)中的ddNTP 與dNTP的比例，使部分引物延伸鏈分別終止于每一個在模板DNA 出現(xiàn)該堿基的位置上。這種測序方式，每個延伸反應(yīng)的產(chǎn)物是一系列長短不一的引物延伸鏈，它們都具有由復(fù)性引物所決定的固定的5’端和終止于某一ddNTP 的不定的3’ 端。

常用的雙脫氧測序法有兩種常用方案。最早期的雙脫氧法，稱之為Sanger 法(Sanger et al. 1977, 1980) ， 是利用大腸桿菌DNA 聚合酶I 的Klenow 片段而發(fā)展起來的 。引物在需要測序的單鏈DNA 模板的3′ 端進行復(fù)性（圖1) 。分成4份進行反應(yīng)，每一份反應(yīng)中都含有DNA 聚合酶、3 種未標(biāo)記的dNTP、一種標(biāo)記的dNTP 及其相應(yīng)的ddNTP （圖1 右側(cè)） 。引物的延伸和標(biāo)記進行至攝入ddNTP 后被終止。在接下來的反應(yīng)中，追加高濃度的4 種dNTP 使未被ddNTP 終止的鏈再延伸

以產(chǎn)生更高分子質(zhì)量的DNA, 這種DNA 鏈滯留在測序膠的頂部無法分辨。測序產(chǎn)物的平均長度通過ddNTP/dNTP 的比率來控制，比率越高產(chǎn)物越短。

標(biāo)記／終止法利用修飾的T7 噬菌體DNA 聚合酶得到進一步發(fā)展。在兩個獨立的反應(yīng)中分別進行引物的標(biāo)記和雙脫氧核苷酸的摻入（圖 1 左側(cè)）。復(fù)性的引物在4 種低濃度dNTP（其中1 種是放射性標(biāo)記的）存在時進行延伸。DNA 的合成持續(xù)到一種或多種dNTP 被耗竭為止，這樣可保證摻入全部的標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸。標(biāo)記的混合物分到4 個獨立的反應(yīng)中，每個反應(yīng)除了含有4 種dNTP 外，還各含4 種ddNTP 中的1種。在鏈終止反應(yīng)步驟中，高濃度的dNTP 保證DNA 逐次合成至生長鏈因ddNTP 的摻入而終止。測序產(chǎn)物的平均鏈長取決于標(biāo)記反應(yīng)中dNTP 的濃度（濃度越高產(chǎn)物越長）和終止反應(yīng)中ddNTP : dNTP 的比例。

當(dāng)使用測序酶的時，標(biāo)記／終止法能得到平均長度長于Sanger 法的測序產(chǎn)物。所以這種方法對于從每個模板上獲得最大散序列的信息是更有利的。對于測定小片段DNA（如證實結(jié)構(gòu)）， Sanger 法通常就足夠了。如確定引物后幾個核苷酸的序列信息， Sanger 法則更可靠。熱穩(wěn)定的DNA 聚合酶也可以用于雙脫氧測序。因為耐熱DNA 聚合酶可以在高溫下工作，可以用它進行熱循環(huán)反應(yīng)，這樣可以提高測序產(chǎn)物的產(chǎn)量，因而提高了靈敏度。此外，熱穩(wěn)定聚合酶可以使DNA 模板的二級結(jié)構(gòu)變性，而DNA 的二級結(jié)構(gòu)會干擾延伸進程。