細胞融合與雜交瘤分選
材料
SP2/0-Ag14 骨髓瘤細胞系（藥物標記的非分泌型； ATCC)
添加10mmol/L HEPES 和1mmol/L 丙酮酸鈉的DMEM- 10 和DMEM-20 完全焙養基
免疫的實驗動物：小鼠、大鼠或倉鼠（在初次接種后10~14d 備用)
50% （m/V) PEG 溶液，無菌
DMEM 完全培養基，未添加血清
氯化銨溶液： 0. 02mol/L Tris ? Cl , pH7. 2 / 0.14mol/L NH4Cl
添加10mmol/L HEPES 、1mmol/L 丙酮酸鈉、1XHAT 或1X HT 的DMEM-20完全培養基
70% （V/V) 乙醇，僅用于容器消毒
175cm2 組織培養用細頸瓶
倒置顯微鏡
400ml 和600ml 燒杯（各3 只）
100mm 有蓋培養皿
尖頭鑷和解剖剪
細網金屬篩
50ml 塑料錐底離心管，無菌
Beckman 離心機和TH-4 轉子或同等設備
96 孔平底微量滴定板
1ml 和10ml 移液管
實驗步驟
1. 細胞融合前一周，開始在添加HEPES 和丙酮酸鈉的DMEM- 10 完全培養基中培養SP2 /0- Ag14 骨髓瘤細胞系（融合用細胞） 。在細胞融合操作前骨髓瘤細胞對于不同的實驗動物應達到以下水平（每個175cm2 培養瓶含培養液100ml ) ： 小鼠， 1 X 108個細胞／瓶， 2 或3 瓶；倉鼠， 2 X 108 個細胞／瓶， 3 或4 瓶；大鼠， 5 X108~1X 109個細胞／瓶， 10 瓶。
兩個小鼠或倉鼠，或一個大鼠的脾即可滿足細胞融合的需要。
2. 細胞融合前3d ，進行二次免疫。
3. 細胞融合前1d , 轉移SP2/0-Ag14 骨髓瘤細胞至新鮮的添加HEPES 和丙酮酸鈉的DMEM- 10 完全培養基中。
4. 在細胞融合前，用倒置顯微鏡確定SP2/0-Ag14 骨髓瘤細胞生長良好（折光力強，未固縮），未污染（沒有明顯的細菌或真菌跡象），并且生長足量。如果骨髓瘤細胞不符合這些要求則暫不進行細胞融合。
5. 將以下物品于37°C 預熱：
3 個400ml 以及3 個600ml 燒杯，每個燒杯內盛100ml 水；
20ml 無菌的未加血清的DMEM 完全培養液；
5 ml 無菌的50 % PEG 溶液。
6. 處死二次免疫的實驗動物。不要用麻醉法處死動物。對于小鼠，應用頸椎脫臼法，對于大鼠和倉鼠應用二氧化碳窒息法， 取脾臟。
7. 將脾臟移至預置了10ml 無菌的未加血清的DMEM 完全培養液的100mm 培養皿中。
以下操作要求在層流罩中超凈工作臺完成。
8. 使用尖頭鑷壓輾或解剖剪將脾組織剪碎，移去組織碎片并通過細網金屬篩進一步分離細胞，制成單細胞懸液。
9. 將脾細胞懸液移至已消毒的50ml 塑料錐底離心管， 并用無血清DMEM 完全培養液加滿離心管（不要使用含有蛋白質或HEPES 的培養液） 。室溫下， TH-4 離心機中500g 離心5min ，棄上清。
10. 在5ml 氯化按溶液中將細胞沉淀重懸以裂解紅細胞。在室溫下靜置5min, 加入45ml 無血清DMEM 完全培養液，如步驟9 進行離心。
11. 加入50ml 無血清DMEM 完全培養液，將沉淀重懸，并再次離心。重復添加DMEM 和離心1次，以完成2 次洗滌。
12. 在洗滌脾細胞的同時，將SP2/0-Ag14 骨髓瘤細胞移入50ml 塑料錐底離心管。如步驟9 進行離心，分離細胞。在DMEM 中重懸細胞，如步驟11 洗滌骨髓瘤細胞3 次。
13. 分別在10ml 無血清DMEM 完全培養液中重懸脾細胞和骨髓瘤細胞。用細胞計數器和臺盼藍拒染試驗對兩種細胞懸液進行細胞計數和活力測定 。此時兩種細胞懸液應該都具有100 ％ 的細胞活力。
14. 在細胞計數的基礎上，以約2. 5 X 106個總細胞數／ml 計算培養細胞所需添加HEPES 和丙酮酸鈉的DMEM-20 培養基的量。37°C 水浴預熱此培養基。取96 孔平底微量滴定板做好標簽備用，每10ml 細胞懸液需準備一個孔板。
15. 將SP2/0-Ag14 骨髓瘤細胞與脾細胞以1 : 1 (V/V) 的比例在50ml 塑料錐底離心管中混合。以無血清DMEM 完全培養液加滿離心管。室溫下， 500g 離心5min。
16. 在進行細胞離心的同時，在層流罩中準備三個600ml 燒杯（步驟5) ，內盛75 ~100ml 37°C 溫水，再將3 個內盛100ml 37°C 溫水的400ml 燒杯分別放入600ml 燒杯中， 形成水浴環境。將預熱的50% PEG 溶液試管與無血清DMEM 完全培養液試管（步驟5) 分別放入2 個37°C 水浴中。
17. 吸取并丟棄混合細胞離心的上清部分（步驟15) ，并將離心管置于第三個水浴燒杯中。使用1ml 移液器向混合細胞沉淀中加入1ml 預熱的50% PEG, 在1min 內勻速逐滴緩慢加入，每加入一滴即用移液器輕輕攪勻細胞。滴加完成后輕輕攪勻1min。
18. 使用干凈的移液管向混合細胞液中逐滴加入預熱的無血清DMEM 完全培養液， 加入的同時輕輕攪勻：
1min 內勻速滴加1ml DMEM;
1min 內勻速滴加1ml DMEM;
2~3min 內勻速滴加7ml DMEM （使用10ml 移液管） 。
注意， 此時應有肉眼可見的細胞團漂浮。室溫下， 500g 離心5min 。
19. 在進行細胞離心的同時，將水浴燒杯重新加熱到37°C ，并放入層流罩。將預熱的添加HEPES 和丙酮酸鈉的DMEM-10 完全培養基放入水浴。
20 . 棄上清（步驟18) ，將試管放入水浴。用干凈的10ml 移液管將預熱的添加HEPES和丙酮酸鈉的DMEM- 10 完全培養基用力吹入細胞沉淀。連續添加，直到將所有培養基加入步驟14 準備的培養基。如果培養基體積超過了50ml, 小心地吸取多余量轉入其他無菌容器，如培養瓶。如果必要， 可用移液管頭壓碎細胞團。此后，不需繼續保待細胞懸液于恒溫水浴中。
21. 小心地用10ml 移液管吸取10ml 細胞懸液（不要使用粗糙的或重復使用的移液管）。小心地在96 孔平底微批滴定板的每個孔中滴加2 滴(100~ 125μl) 細胞懸液。所有細胞懸液滴加完后，用一支干凈的移液管除去過多的細胞懸液。37°C 過夜培養。
為了最大程度地減少成纖維細胞的過度生長，可加入一個可選步驟：在移種到96 孔板之前，可以將完成融合的細胞懸液在培養瓶中培養過夜，以除去貼壁生長的成纖維細胞。
22. 培養一天后，在倒置顯微鏡下檢查細胞生長情況。移種了合適數量細胞的孔底部將出現成片的單層高活力細胞或細胞團。
23. 用10m l 移液管在每個孔中滴加2 滴添加HEPES、丙酮酸鈉和HAT 的DMEM-20完全培養基混合液。每塊孔板需更換不同的移液管頭，并保證板蓋不被互換，之后將孔板置于培養箱。
24. 如果孔板發生污染， 將其丟棄。或者， 如果污染僅限制在1 或2 個孔中，按以下步驟操作：用消毒的巴氏滴管吸取受污染的孔內容物， 移入空培養瓶。用70％乙醇漂洗這些孔，并用已消霉棉簽擦拭。重復洗滌2 次。用蘸有70 ％乙醇的棉簽擦拭周圍。當有其他孔板在層流罩中時，不要打開受污染的孔板。
25. 于培養的第2 、3 、4 、5 、7 、9 、11 天，用已消毒的小號巴氏滴管吸取每個孔的一半培養液，移入空培養瓶。操作時將滴管保持45°傾斜，貼近培養上清的表面吸取。每個孔板需使用不同的滴管。加入添加HEPES、丙酮酸鈉和HAT 的DMEM-20完全培養基混合液（步驟23) ，放回孵箱。如果在第2 天和第3 天沒有發現明顯的細胞死亡跡象，用加有HAT 的培養液培養部分原骨髓瘤細胞，以檢測兩者的質量。
26. 培養4d 后，根據孔中的實際細胞數量、融合效率和雜交瘤的外觀及生長情況來決定是否更換培養基。避免孔中液體變成黃色（酸性）并持續1d 以上。即使不需要更換培養液也應每天檢查孔板，并在出現酸性跡象前更換培養液。
27. 培養第14 天，改用添加HEPES 、丙酮酸鈉和HT 的DMEM-20 完全培養液培養細胞，放回培養箱培養。
28 . 培養第15 天直至最后，改用不添加HAT 或HT 的含有HEPES 和丙酮酸鈉的DMEM-20 完全培養液。當大多數孔內細胞生長到占孔底面積的10%~25 ％時，可以進行雜交瘤篩選。對于生長特別稠密的孔，可以在換液后2d , 培養液變黃時進行細胞篩選（ 一般情況下，小鼠－小鼠細胞或大鼠－小鼠細胞融合后10~14d, 倉鼠－小鼠細胞融合后需14~21d ) 。
如果在篩選檢測中需用3H-胸腺嘧啶核苷攝入試驗， 至少需要更換3或4 次不添加HAT 或HT 的含有HEPES 和丙酮酸鈉的DMEM-20 完全培養液，稀釋殘留的胸腺嘧啶核苷以不影響之后的標記。
相關文章
