實時熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR）是一項以 PCR 反應為基礎的 DNA 定量技術，通過對目標基因在擴增過程中產生的拷貝數進行實時的定量，從而達到對目的基因的定性和定量分析。現有兩種常用的方法對 PCR 產物進行熒光定量：一種是利用熒光染料與雙鏈 DNA 結合，通過熒光強度進行定量；另一種是利用攜帶了熒光報告基團的特異DNA 探針對目標基因進行定量。

一、利用熒光染料進行定量

一種最為常用的定量方法就是在 PCR 反應體系中加入熒光染料，此類熒光染料會與所有的雙鏈 DNA 結合，并產生熒光。游離的熒光分子不會產生熒光信號，只有與雙鏈 DNA 結合的熒光分子才會釋放熒光，隨著 DNA 拷貝數的增加，測得的熒光強度也會增強。

利用熒光染料進行定量的優勢就是成本低廉，只需要一對普通的引物就能完成定量。然而，常用的諸如 SYBR Green 染料會與所有的雙鏈 DNA 無差別地結合，包括引物二聚體， 因此有可能會導致對目標基因的定量不精確，靈敏度偏低。

二、利用熒光探針進行定量

熒光探針只能檢測出與自身序列互補的 DNA 片段，因此用探針法定量可以有效地避免引物二聚體的干擾，使定量結果更加精確。此外，通過使用攜帶不同熒光信號的多種探針， 我們可以同時對一個樣品中的多個靶序列進行定量。

熒光探針的 5’端攜帶有一個熒光報告基團，3’端則為淬滅基團，在正常情況下兩個基團間的距離很近，淬滅基團會抑制報告基團使其無法發出熒光。在 PCR 反應過程中，引物和熒光探針在退火階段都會與目的片段結合；在延伸階段，Taq 酶因為具有 5’-3’核酸外切酶活性，會將探針，使得報告基團和淬滅基團相互分開，從而釋放出熒光。每增加一條目的基因的拷貝，就會有一個探針被切開并釋放熒光信號，因此隨著 PCR 反應的進行，熒光信號會逐漸增強。

使用探針進行熒光定量的優點就是精確度和靈敏度都要比熒光染料高，且可以做到同時對多個基因進行定量，但是相應的合成探針的成本也要比使用熒光染料高出許多。

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