反相高效液相色譜（RP-HPLC）是目前應用最廣泛的一種分析方法，具有分離效率高，選擇性好，檢測靈敏度高，應用范圍廣等特點，約占目前 HPLC 分析應用的 80%。RP-HPLC 固定相主要包含非極性烷基烴，例如與二氧化硅或其他惰性載體結合的 C8 或 C18 鏈。C18 和 C8 是指色譜柱鍵合相的烷基鏈長度。鏈長影響吸附劑相的疏水性，從而增加配體的保留。C18 比其他反相更具疏水性（非極性更強）的原因是碳鏈的長度更長。而在反向高效液相色譜（RP-HPLC）分析的過程中，選擇合適的流動相往往可以控制樣品的保留時間和分離度（圖 1）。
流動相的性質包括有機溶劑的種類、混合比例、添加劑和 pH 值等，這些因素對分析實驗結果產生著不可忽視的作用，因此選擇合適的流動相對于液相色譜的分析至關重要。在反相高效液相色譜中，一般來講，流動相 B 是有機溶劑，常用于泵的流動相混合和梯度洗脫；流動相 A 主要是水，通常也會含有少量控制 PH 和離子強度的改性劑或緩沖鹽等。
圖 1 RP-HPLC 中流動相與固定相之間的相互作用
一、有機相的種類與混合比例
有機相是反相高效液相色譜系統流動相重要組成部分，對 HPLC 分離起到重要作用。比較常見的反相高效液相色譜系統的有機相有：C2 H3N、甲醇、C4 H?O 等。洗脫強度的順序是甲醇。（表 1）
表 1 有機相的洗脫強度
例如，在實際應用中，我們會發現洗脫效果 44% 甲醇/水 = 35% C2 H3N/水 = 28%= C4 H?O/水。雖然 C4 H?O 的洗脫效果比較好，但是由于 C4 H?O 的毒性和安全性問題，導致其在實驗過程中應用的比較少。而日常實驗中應用最多的有機溶劑是 C2 H3N 與甲醇，兩者比較而言，C2 H3N 洗脫強度高、粘度低、紫外干擾弱，但是價格較貴；甲醇洗脫強度不如 C2 H3N、粘度高、在 210nm 以下有著顯著的紫外吸光度，但是甲醇價格較便宜。
一般在初始分離條件中，有機溶劑的比例定為 80%，然后逐步減少有機相比例，直到保留因子（k）落在所期望值的范圍內，即 1 ≤ k ≤ 10，再考慮分離度、拖尾因子和出峰時間等因素，優化出合適的流動相比例。當單獨使用 C2 H3N 和甲醇或單一有機溶劑不能達到洗脫效果時，就應該要考慮有機溶劑的混合使用。若等度洗脫不能有效分離樣品時，就要考慮梯度洗脫的方法。但是使用梯度洗脫時，流動相有機溶劑最高比例不得大于 90%。
二、水相與緩沖鹽的選擇
2.1、水相的選擇
一般化合物可以用純水作為水相，HPLC 用水除滿足藥典的要求外，還要求電導率不得小于 18MΩ·cm（25℃ 時），TOC 不得大于 0.5 mg/ml，在 190nm、200nm 和 250～400nm 的吸收度分別不得大于 0.01、0.01 和 0.05。使用前需經過 0.22μm 濾膜過濾。在液相分析過程中，從樣品和標準制備到柱沖洗和洗脫都需要用到純水，這也使水成為 HPLC 分析過程中消耗量最大的試劑。而水作為實驗分析中常用的試劑，雖然常見，但水的純度也往往是實驗成功與否的關鍵。（圖 2）因此，使用高純度的實驗用水對于色譜分析結果至關重要，色譜儀除了要確保有機溶劑、標準液和其他 HPLC 流動相成分的純度外，還必須確保試劑用水的水質良好，沒有任何污染物。
圖 2 在 C18 色譜柱上進行梯度洗脫。以超純水為流動相 A，C2H3N 為流動相B。結果顯示，水的純度越高，紫外吸收干擾越小
2.2、PH 調節劑和緩沖液
在涉及到藥物分析時，由于大多數藥物是可電離的，即酸性、堿性或兩性離子。因此，必須控制流動相 A 的 pH 值，因為 PH 值會對溶質的分離產生顯著影響。一般情況下需要通過在水中加入 PH 調節劑或者緩沖鹽來調節流動相的 pH 值，從而達到抑制樣品組分解離的目的。
常見的緩沖液和調節 PH 的試劑有磷酸鹽緩沖液、銨鹽緩沖液、C2 HF3O2、甲酸和乙酸等。而緩沖鹽溶液在 HPLC 泵頭內極易出現高壓鹽析現象，磨損密封墊，所以一般將緩沖鹽濃度選定在樣品濃度的 2～5 倍，大致為 5～50 mM。
2.3、離子對試劑的選擇
離子對試劑主要用于離子型樣品和極性較大，在反相色譜系統中不易保留的被分析物。當根據反相色譜方法初步摸索確定必須要使用離子對試劑時，首先根據化合物峰的酸堿性（通過改變 pH 來判斷）確定添加哪種類型的離子對試劑；然后加入一個初始濃度的離子對試劑；最后通過改變流動相 B% 或者溫度、流動相 pH 及離子對試劑濃度進行調整選擇性。在流動相中添加離子對試劑可以改善堿性物質色譜峰的拖尾，增加原本保留很弱的酸性或者堿性離子化合物的保留（并且 K 值合理）。這和反向色譜法中改變流動相 pH 導致化合物的保留時間變化性質差不多，但是離子對色譜法能夠更好的控制酸性或者堿性化合物的保留時間和分離度，而且無須將流動相 pH 調整到極端的水平（pH 小于 2.5 或者大于 8）。
圖 3 IPC 離子對試劑工作原理。通過與流動相中的離子對試劑相互作用來改變分析物的極性。
