反相高效液相色譜（RP-HPLC）是目前應(yīng)用最廣泛的一種分析方法，具有分離效率高，選擇性好，檢測靈敏度高，應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，約占目前 HPLC 分析應(yīng)用的 80%。RP-HPLC 固定相主要包含非極性烷基烴，例如與二氧化硅或其他惰性載體結(jié)合的 C8 或 C18 鏈。C18 和 C8 是指色譜柱鍵合相的烷基鏈長度。鏈長影響吸附劑相的疏水性，從而增加配體的保留。C18 比其他反相更具疏水性（非極性更強(qiáng)）的原因是碳鏈的長度更長。而在反向高效液相色譜（RP-HPLC）分析的過程中，選擇合適的流動(dòng)相往往可以控制樣品的保留時(shí)間和分離度（圖 1）。
流動(dòng)相的性質(zhì)包括有機(jī)溶劑的種類、混合比例、添加劑和 pH 值等，這些因素對(duì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生著不可忽視的作用，因此選擇合適的流動(dòng)相對(duì)于液相色譜的分析至關(guān)重要。在反相高效液相色譜中，一般來講，流動(dòng)相 B 是有機(jī)溶劑，常用于泵的流動(dòng)相混合和梯度洗脫；流動(dòng)相 A 主要是水，通常也會(huì)含有少量控制 PH 和離子強(qiáng)度的改性劑或緩沖鹽等。
圖 1 RP-HPLC 中流動(dòng)相與固定相之間的相互作用
一、有機(jī)相的種類與混合比例
有機(jī)相是反相高效液相色譜系統(tǒng)流動(dòng)相重要組成部分，對(duì) HPLC 分離起到重要作用。比較常見的反相高效液相色譜系統(tǒng)的有機(jī)相有：C2 H3N、甲醇、C4 H?O 等。洗脫強(qiáng)度的順序是甲醇。（表 1）
表 1 有機(jī)相的洗脫強(qiáng)度
例如，在實(shí)際應(yīng)用中，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)洗脫效果 44% 甲醇/水 = 35% C2 H3N/水 = 28%= C4 H?O/水。雖然 C4 H?O 的洗脫效果比較好，但是由于 C4 H?O 的毒性和安全性問題，導(dǎo)致其在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)用的比較少。而日常實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最多的有機(jī)溶劑是 C2 H3N 與甲醇，兩者比較而言，C2 H3N 洗脫強(qiáng)度高、粘度低、紫外干擾弱，但是價(jià)格較貴；甲醇洗脫強(qiáng)度不如 C2 H3N、粘度高、在 210nm 以下有著顯著的紫外吸光度，但是甲醇價(jià)格較便宜。
一般在初始分離條件中，有機(jī)溶劑的比例定為 80%，然后逐步減少有機(jī)相比例，直到保留因子（k）落在所期望值的范圍內(nèi)，即 1 ≤ k ≤ 10，再考慮分離度、拖尾因子和出峰時(shí)間等因素，優(yōu)化出合適的流動(dòng)相比例。當(dāng)單獨(dú)使用 C2 H3N 和甲醇或單一有機(jī)溶劑不能達(dá)到洗脫效果時(shí)，就應(yīng)該要考慮有機(jī)溶劑的混合使用。若等度洗脫不能有效分離樣品時(shí)，就要考慮梯度洗脫的方法。但是使用梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相有機(jī)溶劑最高比例不得大于 90%。
二、水相與緩沖鹽的選擇
2.1、水相的選擇
一般化合物可以用純水作為水相，HPLC 用水除滿足藥典的要求外，還要求電導(dǎo)率不得小于 18MΩ·cm（25℃ 時(shí)），TOC 不得大于 0.5 mg/ml，在 190nm、200nm 和 250～400nm 的吸收度分別不得大于 0.01、0.01 和 0.05。使用前需經(jīng)過 0.22μm 濾膜過濾。在液相分析過程中，從樣品和標(biāo)準(zhǔn)制備到柱沖洗和洗脫都需要用到純水，這也使水成為 HPLC 分析過程中消耗量最大的試劑。而水作為實(shí)驗(yàn)分析中常用的試劑，雖然常見，但水的純度也往往是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。（圖 2）因此，使用高純度的實(shí)驗(yàn)用水對(duì)于色譜分析結(jié)果至關(guān)重要，色譜儀除了要確保有機(jī)溶劑、標(biāo)準(zhǔn)液和其他 HPLC 流動(dòng)相成分的純度外，還必須確保試劑用水的水質(zhì)良好，沒有任何污染物。
圖 2 在 C18 色譜柱上進(jìn)行梯度洗脫。以超純水為流動(dòng)相 A，C2H3N 為流動(dòng)相B。結(jié)果顯示，水的純度越高，紫外吸收干擾越小
2.2、PH 調(diào)節(jié)劑和緩沖液
在涉及到藥物分析時(shí)，由于大多數(shù)藥物是可電離的，即酸性、堿性或兩性離子。因此，必須控制流動(dòng)相 A 的 pH 值，因?yàn)?PH 值會(huì)對(duì)溶質(zhì)的分離產(chǎn)生顯著影響。一般情況下需要通過在水中加入 PH 調(diào)節(jié)劑或者緩沖鹽來調(diào)節(jié)流動(dòng)相的 pH 值，從而達(dá)到抑制樣品組分解離的目的。
常見的緩沖液和調(diào)節(jié) PH 的試劑有磷酸鹽緩沖液、銨鹽緩沖液、C2 HF3O2、甲酸和乙酸等。而緩沖鹽溶液在 HPLC 泵頭內(nèi)極易出現(xiàn)高壓鹽析現(xiàn)象，磨損密封墊，所以一般將緩沖鹽濃度選定在樣品濃度的 2～5 倍，大致為 5～50 mM。
2.3、離子對(duì)試劑的選擇
離子對(duì)試劑主要用于離子型樣品和極性較大，在反相色譜系統(tǒng)中不易保留的被分析物。當(dāng)根據(jù)反相色譜方法初步摸索確定必須要使用離子對(duì)試劑時(shí)，首先根據(jù)化合物峰的酸堿性（通過改變 pH 來判斷）確定添加哪種類型的離子對(duì)試劑；然后加入一個(gè)初始濃度的離子對(duì)試劑；最后通過改變流動(dòng)相 B% 或者溫度、流動(dòng)相 pH 及離子對(duì)試劑濃度進(jìn)行調(diào)整選擇性。在流動(dòng)相中添加離子對(duì)試劑可以改善堿性物質(zhì)色譜峰的拖尾，增加原本保留很弱的酸性或者堿性離子化合物的保留（并且 K 值合理）。這和反向色譜法中改變流動(dòng)相 pH 導(dǎo)致化合物的保留時(shí)間變化性質(zhì)差不多，但是離子對(duì)色譜法能夠更好的控制酸性或者堿性化合物的保留時(shí)間和分離度，而且無須將流動(dòng)相 pH 調(diào)整到極端的水平（pH 小于 2.5 或者大于 8）。
圖 3 IPC 離子對(duì)試劑工作原理。通過與流動(dòng)相中的離子對(duì)試劑相互作用來改變分析物的極性。
