HPLC分析流程

一、梯度洗脫條件的設置

典型的梯度洗脫是用兩種溶劑做流動相，弱溶劑 A 和強溶劑 B，在反相色譜分離中溶劑 A 大都是水，溶劑 B 是甲醇或者乙 jing 等強溶劑。所有的梯度洗脫中溶劑強度不斷增加，即 B 的濃度不斷增加。例如, 流動相中溶劑 B 的含量在一定時間內梯度從 20% 提高到 80%。梯度控制器決定流動相的組成，可通過輸入不同的條件實現：

①流動相 (梯度洗脫開始時): cB(%);

②流動相 (梯度洗脫結束時): cB(%);

③從分離開始到結束的梯度時間;

④梯度形狀;

等度洗脫、線性洗脫、梯度洗脫分離效果

二、負峰的消除

從方法原理上講, 當樣品池的吸收值低于參比池時可產生負峰現象, 因此要求用流動相

溶解樣品或稀釋樣品。當分析物為兩性化合物時，由于樣品本身極性較大，且化合物結構中含有氨基，極有可能與檢測池壁產生相互作用, 產生負峰現象，這種情況下需要在流動相中加入 NH4+來減少負峰現象。

三、進樣量對分離效果的影響

一般在保證靈敏度的前提下應盡量減少進樣量，以避免可能發生的溶劑效應。特別是于樣品性質的特殊性不同，導致溶解樣品的溶劑與流動相組成不同時更應注意該問題，需要保證每次的進樣量在 1μL-5μL。例如，在做靛藍、靛玉紅分析時, 對照品及樣品溶液為氯 fang 溶液, 流動相為甲醇/水 (70:30), 當進樣量為 20μL 時, 色譜系統會出現異常峰, 再次將進樣量改為 10μL 時則出峰正常。

四、含有氨基結構化合物的峰拖尾問題

氨基化合物拖尾峰

五、流動相中甲醇與乙 jing 的選擇

常用做反相流動相的溶劑是甲醇和乙 jing。乙 jing 雖然價格很高，毒性比甲醇大，但是洗脫能力比甲醇強，很少與樣品發生反應，用作流動相系統常用做反相流動相的溶劑是甲醇和乙 jing，甲醇有其性價比的優勢，但是甲醇活性高，可能與某些樣品發生反應，而且甲醇在低波長下有紫外吸收，會降低分析方法的靈敏度。

Thermo ScientificTM ChrompleteTM 色譜通溶劑，一瓶通用。適用于多種應用：

• HPLC: UV、UV-Vis、PDA、ECD、FL 或 RI 檢測器  

• GC: FID、ECD 或 TCD 檢測器  

• 紫外分光光度法

• 萃取、純化和超臨界流體色譜

• 優勢--兼容多種應用場景，減少實驗室所需的試劑瓶數量，大大簡化庫存管理并減少試劑浪費。

六、流動相的PH問題

利用反相色譜法分離弱酸（3 ≤ pKa ≤ 7）或弱堿（7 ≤ pKa ≤ 8）樣品時，可以通過調節流動相的 pH 值，以抑制樣品組分的解離，從而增加組分在固定相上的保留，并改善目標化合物的峰形。對于弱酸性化合物來講，流動相的 pH 值越小，組分的 k 值越大；當 pH 值遠遠小于弱酸的 pKa 值時，弱酸主要以分子形式存在。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用 50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液和 1% 醋 suan 溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用 50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液和 30 mmol/L 三乙 an 溶液。注：流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質與殘余硅羥基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。